克隆载体与表达载体

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1、如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流克隆载体与表达载体【精品文档】第10页如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流克隆载体基本性质基本特征（或载体的构建）原理机制常用的载体克隆载体质粒载体质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制；不相容性；可转移性（基因工程中采用非接合性质粒）（1）具有合适的复制起始位点（ORI）（2）具有合适的选择性标记基因（3）若干限制性内切酶的单一位点（4）具有较小的分子量和较高的拷贝数。当带有抗菌素抗性基因的载体进入受体菌后，受体菌才能生长。不带有抗菌素抗性基因的受体菌不能在含有抗菌素的培养基（选择培养基）中生

2、长。（抗菌素选择原理）噬菌体载体λ噬菌体其DNA两端的5′末端各带有12个碱基的互补单链，即cos位点。有可替代区，即非必需区。用外源DNA片段替代这个区域，不会影响噬菌体颗粒的形成。(1)基因组大小；去除非必需区，建立外源DNA片段的克隆或替换位点（2）在DNA的非必需区插入选择标记：lacZ基因；基因cⅠ失活（cI基因：溶源过程控制基因）；Spi筛选（野生型λ噬菌体在带有P2原噬菌体的溶源性E.coli中的生长会受到限制的表型，称作Spi+，即对P2噬菌体的干扰敏感）1)通过裂解过程增殖载体2)载体与外源DNA的酶切3)外源DNA与载体的连接

3、4)重组噬菌体的体外包装5)包装噬菌体颗粒的感染6)筛选（λ噬菌体载体的克隆原理）插入式载体置换型载体（取代型载体）M13噬菌体载体M13噬菌体的基因组为单链DNA。噬菌体颗粒的大小受其DNA端点制约的，不存在包装限制。只感染雄性大肠杆菌基因间隔区（intergenicregion,IG区）基因II与基因IV之间存在一段507bp的基因间隔区，内含有复制起始位点，是实施改造、构建人工载体的重点区域。②IG区内只有一个BsuI切点。（2）加入酶切位点，在IG区内加入单一内切酶位点。M13mp1在IG区内插入一个大肠杆菌的LacZ’（a-肽序列)。使

4、克隆的DNA1、以（+）链DNA为摸板，合成互补（－）链，该双链称复制型DNA（RFDNA）。2、RFDNA在宿主细胞内能快速增殖，可增加到每个细胞约200个拷贝。3、单链特异的DNA结合蛋白结合在（+）链上，从而阻断了其互补链，即（－）链的合成，这样，细胞就会不断的合成（+）链DNAM13mpnn代表系列数字②对M13mp1的改进加上常用的酶切位点。M13mp2：LacZ’5’【精品文档】第10页如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流片段以特定单链的形式输出受体细胞外，M13重组分子筛选简便，被M13噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混浊斑，

5、易于辨认挑选。而且重组分子越大，混浊斑的混浊度亦越大但M13-DNA载体的最大缺陷是装载量小，只有1.5kb4、游离出来的（+）链DNA先与基因V的编码产物形成特异的DNA-蛋白质复合物，然后转移到寄主细胞膜，同时基因V的蛋白质从（+）DNA链上脱落下来，余下的M13（+）链DNA则是从其感染的寄主细胞的细胞膜溢出的过程中，被外壳蛋白包装成病毒颗粒的。（M13噬菌体产生单双链DNA的机制）端的第13个核苷酸G突变成A，产生了一个EcoRI切点噬菌体-质粒杂合载体黏粒载体考斯质粒是一类人工构建的含有λ-DNAcos序列和质粒复制子的的特殊类型载体。

6、能像l-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞；能像质粒那样在受体细胞中自主复制具有较高容量的克隆能力：45kb；具有与同源性序列的质粒进行重组的能力粘粒（cosmid）是带有cos序列的质粒。cos序列是l噬菌体DNA中将DNA包装到噬菌体颗粒中所需的DNA序列。黏粒的组成包括质粒复制起点（colE1），抗性标记（ampr），cos位点，因而能象质粒一样转化和增殖。克隆的最大DNA片段可达45kb。有的粘粒载体含有两个cos位点，在某种程度上可提高使用效率。设计构建的柯斯质粒一般长4～6kb。其上的cos位点的一个重要作用是识别噬菌体的外壳

7、蛋白。凡具有cos位点的任何DNA分子只要在长度相当于噬菌体基因组，就可以同外壳蛋白结合而被包装成类似噬菌体λ的颗粒。因此，插入柯斯质粒的外源DNA可大于40kb。重组的柯斯质粒可象噬菌体λ一样感染大肠杆菌，并在细菌细胞中复制。噬菌粒载体能像质粒那样在受体细胞中自主复制能像M13-DNA那样体外包装，并高效转染受体细胞装载量比常规的M13mp系列要大很多（10kb通过克隆双链DNA能获得同等长度的单一单链DNA噬菌粒载体综合了质粒载体和M13噬菌体载体优点，含有ColEl复制起始位点、抗生素抗性选择标记和丝状体噬菌体DNA间隔区(含有噬菌体DNA

8、复制起始、终止以及噬菌体颗粒形态发生所必需的全部顺式作用元件)它具有质粒的复制起点、选择性标记、多克隆位点等，方便DNA1.具有较小分子