2型囊泡谷氨酸转运体在神经病理性疼痛中的作用及其表达调控机制研究

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分类号学号152076ＵＤＣ密级公开军事科学院博士学位论文2型囊泡谷氨酸转运体在神经病理性疼痛中的作用及其表达调控机制研究TheRoleofVesicularGlutamateTransporter2inNeuropathicPainandItsExpressionalRegulationMechanism作者姓名张志玲学科专业药理学指导教师苏瑞斌研究员俞纲副研究员答辩主席张永鹤学位授予单位军事科学院论文提交日期2018年6月2日 军事科学院博士学位论文目录缩略词表.................................................................................................................................................1中文摘要.................................................................................................................................................3Abstract....................................................................................................................................................8前言...............................................................................................................................................14第一部分神经痛模型动物脊髓VGLUT2表达变化.....................................................................211实验材料.......................................................................................................................................212实验方法.......................................................................................................................................252.1试剂配方.................................................................................................................................252.2机械痛阈测定........................................................................................................................262.3坐骨神经分支选择性损伤（SNI）模型构建....................................................................272.4真核表达质粒pcDNA3.1/myc-His-VGLUT2构建...........................................................272.5PC12细胞转染......................................................................................................................292.6蛋白免疫印迹实验................................................................................................................312.7免疫组化实验........................................................................................................................332.8组织免疫荧光双重标记实验...............................................................................................342.9定量和统计分析....................................................................................................................353实验结果.......................................................................................................................................353.1VGLUT2抗体验证...............................................................................................................353.2SNI神经病理性痛模型的构建及验证...............................................................................373.3SNI术后不同时间点脊髓VGLUT2表达变化.................................................................384小结...............................................................................................................................................41第二部分VGLUT2shRNA慢病毒对神经痛及谷氨酸释放的影响............................................421实验材料.......................................................................................................................................422实验方法.......................................................................................................................................462.1试剂配方.................................................................................................................................462.2含GFP荧光标记的VGLUT2shRNA慢病毒载体构建..................................................472.3表达VGLUT2shRNA的慢病毒载体包装........................................................................482.4原代神经元培养....................................................................................................................482.5细胞免疫荧光实验................................................................................................................492.6原代培养神经元的病毒感染...............................................................................................492.7Real-timePCR和蛋白免疫印迹检测原代培养神经元VGLUT2表达..........................49 军事科学院博士学位论文2.8机械痛阈测定........................................................................................................................512.9SNI模型构建.........................................................................................................................512.10鞘内注射VGLUT2shRNA慢病毒..................................................................................512.11丘脑VPL脑区微量注射VGLUT2shRNA慢病毒........................................................512.12原代培养神经元谷氨酸释放实验.....................................................................................522.13脊髓、丘脑突触体谷氨酸释放实验.................................................................................522.14定量和统计分析..................................................................................................................533实验结果.......................................................................................................................................533.1VGLUT2shRNA重组慢病毒载体制备与筛选..................................................................533.2鞘内注射VGLUT2shRNA慢病毒对SNI小鼠机械痛阈的影响..................................563.3丘脑VPL脑区注射VGLUT2shRNA慢病毒对SNI小鼠机械痛阈的影响................583.4VGLUT2shRNA慢病毒对谷氨酸释放的影响.................................................................614小结...............................................................................................................................................63第三部分神经痛模型动物Wnt/β-catenin信号通路的变化及其在VGLUT2表达调控中的作用............................................................................................................................................................641实验材料.......................................................................................................................................642实验方法.......................................................................................................................................652.1药品配置.................................................................................................................................652.2机械痛阈测定........................................................................................................................662.3SNI模型构建.........................................................................................................................662.4Real-timePCR检测脊髓Wnt基因mRNA水平..............................................................662.5蛋白免疫印记检测Wnt1、β-catenin蛋白表达................................................................662.6鞘内注射VGLUT2shRNA慢病毒、XAV939、Wnt激动剂、Wnt1、BDNF............662.7定量和统计分析....................................................................................................................673实验结果.......................................................................................................................................673.1小鼠SNI术后不同时间Wnt/β-catenin信号分子的表达变化........................................673.2Wnt/β-catenin信号通路对VGLUT1、VGLUT2蛋白表达的影响................................703.3BDNF对VGLUT1、VGLUT2蛋白表达的影响.............................................................723.4Wnt/β-catenin信号通路介导的VGLUT2表达调控在神经痛中的作用.......................734小结...............................................................................................................................................77讨论...............................................................................................................................................78结论...............................................................................................................................................85参考文献...............................................................................................................................................86 军事科学院博士学位论文作者在学期间取得的学术成果..........................................................................................................97主要简历.............................................................................................................................................104致谢.............................................................................................................................................105 军事科学院博士学位论文缩略词表英文缩写英文全称中文全称AMPAα-amino-3-hydroxyl-5-methyl-α-氨基羟甲基恶唑丙酸4-isoxazole-propionateANOVAanalysisofvariance方差分析ATPadenosinetriphosphate腺嘌呤核苷三磷酸BCAbicinchoninicacid2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠BDNFbrainderivedneurotrophicfactor脑源性神经营养因子BSAbovineserumalbumin牛血清白蛋白CCIchronicconstrictioninjury坐骨神经慢性压迫性损伤Contracontralateral对侧CSB6BChicagoskyblue6B芝加哥天蓝DAB3,3’-diaminobenzidine3,3’-二氨基联苯胺DRGdorsalrootganglion被根神经节DTT1,4-dithiothreitol1,4-二硫苏糖醇EAATsexcitatoryaminoacidtransporters质膜谷氨酸转运体EDTAethylenediaminetetraaceticacid乙二胺四乙酸HEPES4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine4-羟乙基哌嗪乙磺酸ethanesulfonicacidHBMHEPESbuffermediumHEPES缓冲介质GFAPglialfibrillaryacidicprotein胶质纤维酸性蛋白Gluglutamate谷氨酸i.t.intrathecalinjection鞘内注射i.p.intraperitonealy腹腔注射ipsiipsilateral同侧LTDlong-termdepression长时程抑制LTP1ong-termpotentiation长时程增强mPFCmedialprefrontalcortex内侧前额叶皮层mRNAmessengerribonucleicacid信使核糖核酸MWTmechanicalwithdrawalthreshold机械缩足痛阈值NMDAN-methylDaspartateN-甲基天冬氨酸1 军事科学院博士学位论文PCRpolymerasechainreaction聚合酶链反应PBSphosphatebufferedsaline磷酸缓冲盐溶液PMSFphenylmethylsulfonylfluoride苯甲基磺酰氟SDSsodiumdodecylsulphate十二烷基硫酸钠SNIsparednerveinjury坐骨神经分支选择性损伤TRPV1transientreceptorpotentialfamily瞬时受体电位香草酸亚vanilloidsubtype1型1VPLventralposterolateralnucleus丘脑腹后外侧核VGLUTvesicularglutamatetransporter囊泡谷氨酸转运体2 军事科学院博士学位论文2型囊泡谷氨酸转运体在神经病理性疼痛中的作用及其表达调控机制研究中文摘要研究背景谷氨酸在疼痛信息的感知、传递和调控中发挥了重要作用。研究证实，谷氨酸的过度释放与神经病理性痛的发生发展密切相关。囊泡谷氨酸转运体（vesicularglutamatetransporters，VGLUTs）是突触前负责将谷氨酸转运到囊泡内的转运体蛋白质，因此对以胞吐形式释放的谷氨酸能神经递质具有重要的调控作用。目前已知的VGLUTs包含三种亚型，其中2型囊泡谷氨酸转运体（vesicularglutamatetransporter2，VGLUT2）主要分布于背根神经节（dorsalrootganglia，DRG）、脊髓、脑干和丘脑等与疼痛信号传递和加工密切相关的部位或区域。有文献报道VGLUT2全身敲除杂合子小鼠的神经病理性疼痛症状消失或减弱，同时VGLUT2全身敲除纯合子胎鼠丘脑神经元兴奋性突触后电流的幅度和频率下降；条件性敲除DRG中VGLUT2导致小鼠热痛觉过敏消失，但机械痛敏维持正常。以上研究提示，VGLUT2可能与疼痛，尤其是神经病理性痛有关，但在丘脑、脊髓及DRG中的作用有所差异。本实验室前期研究发现，神经病理性痛引起脊髓和丘脑等疼痛相关脑区VGLUT2表达升高；VGLUTs抑制剂CSB6B可显著降低丘脑谷氨酸释放，同时缓解神经病理性痛的行为表现。然而，CSB6B对三种VGLUT亚型均具有抑制活性，难以说明VGLUT2的特异性作用。此外，生理病理条件下VGLUT2的表达调控目前仍不明确。一些研究提示Wnt/β-catenin信号通路能够调控谷氨酸能神经传递，而且经典和非经典Wnt信号通路在神经病理性痛中均发挥了重要作用，但这一作用是否与VGLUT2相关尚不清楚。因此，明确1）VGLUT2表达在神经病理性痛发展过程中是如何变化的？2）特异性干扰VGLUT2对神经病理性痛有何影响？3）神经病理性痛条件下Wnt/β-catenin信号通路是否通过VGLUT2发挥调控作用？将为确定VGLUT2能否成为神经病理性痛治疗靶点提供关键的实验证据和理论基础。研究目的本课题的研究目的是进一步阐明VGLUT2在神经病理性疼痛中的作用，并在模型动物上探讨Wnt/β-catenin信号通路对VGLUT2蛋白表达调控的影响及其与疼痛行为的相关性。3 军事科学院博士学位论文研究思路与方法为了阐明VGLUT2与神经病理性疼痛的相关性，本课题首先明确病理条件下VGLUT2的表达变化及细胞分布规律，进而构建表达VGLUT2shRNA的慢病毒载体，分别研究丘脑和脊髓选择性下调VGLUT2对神经病理性疼痛行为的影响；并应用Wnt激动剂或拮抗剂，观察Wnt/β-catenin信号通路对VGLUT2蛋白水平的影响及与疼痛行为的相关性。1.神经病理性疼痛模型动物脊髓VGLUT2的表达变化建立模拟临床外伤所致神经病理性痛的小鼠坐骨神经分支选择性损伤（sparednerveinjury，SNI）模型，用VonFrey纤维丝检测动物损伤侧足底外侧（即腓肠神经支配域）机械痛阈的变化。在SNI术后不同时间点（第1、4、7、14、21天），利用蛋白免疫印迹、免疫组化方法检测脊髓VGLUT2蛋白表达变化。分别以NeuN、MAP2、IBA1和GFAP标记神经元胞体、突起、小胶质细胞和星形胶质细胞，利用免疫荧光双重标记方法观察神经病理性痛小鼠脊髓背角VGLUT2在不同类型细胞的分布情况。2.VGLUT2shRNA慢病毒对神经病理性痛及谷氨酸释放的影响利用InvitrogenBLOCK-iT™RNAiDesigner网站设计VGLUT2shRNA序列，包装成表达VGLUT2shRNA的慢病毒载体，在原代培养神经元中检测VGLUT2shRNA慢病毒对VGLUT2基因、蛋白水平和谷氨酸释放的影响。将靶向VGLUT2的慢病毒shRNA质粒于小鼠SNI术前第7天或术后第4天进行鞘内注射或者定位注射至丘脑腹后外侧核（ventralposterolateralnucleus，VPL），检测动物机械痛阈值的变化。于SNI术后第7天提取脊髓和VPL突触体，检测去极化处理引起的谷氨酸释放情况。3.神经损伤诱导的Wnt/β-catenin信号通路改变及其对VGLUT2表达和疼痛行为的影响在PC12细胞中观察β-catenin过表达、Wnt3a或XAV939（Wnt/β-catenin信号通路抑制剂）处理对VGLUT2蛋白表达的影响。在整体动物水平，观察鞘内注射Wnt激动剂或XAV939对VGLUT2蛋白表达的影响。为研究病理条件下VGLUT2的表达调控机制，在SNI术后不同时间点（第1、4、7、14、21天）对脊髓Wnt因子以及β-catenin蛋白表达进行检测。为了探讨Wnt/β-catenin通路调控VGLUT2表达在SNI所致疼痛行为中的作用，1）于SNI术后VGLUT2蛋白显著上调时（第7天）鞘内给予抑制剂XAV939，观察动物机械痛阈值及VGLUT2表达变化；2）在鞘内给予VGLUT2shRNA慢病毒后第14天鞘内注射Wnt激动剂或Wnt1因子，观察动物机械痛阈值的变化情况。4 军事科学院博士学位论文研究结果1.SNI术后不同时间点脊髓VGLUT2蛋白表达变化及细胞类型定位情况蛋白免疫印记结果显示，SNI手术使小鼠脊髓VGLUT2蛋白表达发生显著性变化（F[6,36]=6.249,p<0.0001）。与Naive动物相比，SNI术后第7、14、21天VGLUT2蛋白表达分别升高了31%±9%（p<0.05）、33%±11%（p<0.05）、27%±7%（p<0.05）。免疫组化结果显示SNI术后第14天脊髓VGLUT2显著升高（p<0.05）。VGLUT2分别与细胞蛋白标志物（NeuN、MAP2、IBA1、GFAP）免疫荧光双重标记结果显示，SNI术后脊髓背角中VGLUT2主要表达于神经元中（NeuN、MAP2）。2.VGLUT2shRNA慢病毒对神经病理性痛及谷氨酸释放的影响2.1原代培养神经元中VGLUT2shRNA的筛选及对谷氨酸释放的影响三条干扰序列以慢病毒包装后加入原代神经元培养基中，10天后三条序列均显著下调VGLUT2的mRNA表达水平，但只有shRNA-1和shRNA-2显著下调VGLUT2的蛋白表达水平，其中shRNA-1使VGLUT2的mRNA和蛋白分别下调至16%±1.5%和43%±10.3%；shRNA-2使VGLUT2的mRNA和蛋白分别下调至13%±1.5%和20%±5.1%。原代神经元谷氨酸释放实验显示，与shRNA-Sc相比shRNA-1（33.82±0.66µMvs.20.39±1.17µM,p<0.05）和shRNA-2（33.82±0.66µMvs.18.97±1.09µM,p<0.05）显著降低培养基中谷氨酸浓度。2.2SNI术前或术后注射VGLUT2shRNA慢病毒对动物机械痛阈值及突触体谷氨酸释放的影响鞘内注射VGLUT2shRNA慢病毒不影响小鼠基础机械痛阈。SNI手术前第7天鞘内给予VGLUT2shRNA慢病毒显著降低SNI所致机械痛觉过敏（F[5,168]=261.78,p<0.0001），且术后第4、7、10、14天具有显著性差异。SNI术后第4天鞘内给予VGLUT2shRNA慢病毒显著升高动物机械痛阈值（F[5,168]=367.28,p<0.0001），且术后第7、10、14天具有显著性差异。SNI手术前第7天丘脑VPL脑区注射VGLUT2shRNA慢病毒显著升高动物机械痛阈值（F[5,164]=316.4,p<0.0001），且术后第4、7、10、14天具有显著性差异。SNI术后第4天VPL脑区给予VGLUT2shRNA慢病毒显著升高动物的机械痛阈值（F[5,164]=284.93,p<0.0001），且术后第7、10、14天具有显著性差异。在突触体谷氨酸释放实验中，与正常动物相比SNI手术使脊髓突触体谷5 军事科学院博士学位论文氨酸释放水平显著升高（7.34±0.42nmol/mgvs.11.94±0.57nmol/mg,p<0.05），鞘内注射VGLUT2shRNA慢病毒显著降低SNI动物脊髓突触体谷氨酸释放量（p<0.05），丘脑VPL脑区注射VGLUT2shRNA慢病毒显著下调VPL突触体中谷氨酸释放量（8.12±0.24nmol/mgvs.7.31±0.21nmol/mg,p<0.05）。3.神经病理性痛对Wnt/β-catenin信号通路的表达影响及其在VGLUT2表达调控中的作用3.1SNI术后Wnt/β-catenin信号通路的表达变化SNI术后，Wnt1mRNA（F[2,12]=11.45,p<0.0001）、Wnt1蛋白（F[2,10]=9.279,p<0.001）和β-catenin蛋白（F[3,15]=6.312,p<0.001）表达变化具有显著性，Wnt1mRNA术后第7、14、21天显著上升（p<0.05），Wnt1蛋白术后第1、4、7、14、21天显著上升（p<0.05），β-catenin蛋白术后第1、4、7、14、21天显著上升。SNI术后第14天前额皮质中β-catenin蛋白表达显著升高，伏隔核、杏仁核中的β-catenin显著降低，而海马、丘脑中的β-catenin没有发生变化。3.2Wnt/β-catenin信号通路、BDNF信号通路对VGLUT1、VGLUT2蛋白表达的影响在PC12细胞中，β-catenin过表达或Wnt3a处理能够升高VGLUT1、VGLUT2蛋白表达水平，而用Wnt/β-catenin信号通路抑制剂XAV939处理能降低VGLUT1、VGLUT2蛋白表达。在整体动物中，鞘内给予Wnt激动剂或者Wnt1因子能够显著升高脊髓VGLUT2蛋白表达水平，鞘内给予XAV939能够显著降低脊髓VGLUT1、VGLUT2蛋白表达水平，鞘内注射BDNF能够显著升高脊髓VGLUT1、VGLUT2和β-catenin蛋白表达水平。3.3Wnt/β-catenin信号通路对VGLUT2蛋白表达的调控及其对疼痛行为的影响SNI术后第7天鞘内给予XAV939显著影响小鼠机械痛觉过敏（F[2,108]=401.05,p<0.0001），给药后2h动物机械痛阈值开始上升，6h后达到最大值（0.522±0.071gvs.0.044±0.015g,p<0.01），12h后基本恢复到了给药前的痛阈值水平。VGLUT2蛋白表达检测结果显示，给药后6hVGLUT2和β-catenin蛋白表达与模型组相比显著下降，而给药后12hβ-catenin蛋白表达依然处于下降水平，但是VGLUT2蛋白恢复至给药前水平。正常动物鞘内注射Wnt激动剂，动物在给药后第3、6、9、12h机械痛阈值显著降低，干扰VGLUT2表达显著对抗Wnt激动剂的效应（F[3,84]=10.56,p<0.001）。正常动物鞘内注射Wnt1，动物在给药后的第3、6、9、12h机械痛阈值显著6 军事科学院博士学位论文降低，干扰VGLUT2表达显著对抗Wnt1的效应（F[3,96]=38.21,p<0.0001）。结论神经病理性痛使小鼠脊髓VGLUT2表达升高，敲减VGLUT2显著抑制痛觉过敏，表明VGLUT2是参与神经病理性痛发生发展的重要分子。VGLUT2参与神经病理性痛与其抑制谷氨酸释放有关。神经病理性疼痛条件下，Wnt/β-catenin信号通路正向调控VGLUT2蛋白表达，并且这种调控与神经病理性痛行为密切相关。关键词：VGLUT2；神经病理性疼痛；RNA干扰；Wnt/β-catenin信号通路7 军事科学院博士学位论文TheRoleofVesicularGlutamateTransporter2inNeuropathicPainandItsExpressionalRegulationMechanismAbstractBackgroundGlutamateplaysanimportantroleinsense,transmissionandregulationofpainsignals.Up-regulationofglutamatereleasehasbeenproposedtobeacriticalmechanismofneuropathicpain.Vesicularglutamatetransporters(VGLUTs),whichtransportglutamateintopre-synapticvesicles,playacrucialroleintheregulationofglutamatergicneurotransmitterrelease.AmongthethreeVGLUTisoforms,VGLUT2wasabundantlyexpressedinthedorsalrootganglia(DRG),spinalcord,brainstem,andthalamus,whichareallkeycomponentsofthenociceptivepathways.VGLUT2deficiencyinheterozygousknockoutmicesubstantiallyattenuatesneuropathicpainsymptoms,andthelossofVGLUT2inhomozygousknockoutmiceleadstoreductioninfrequencyandamplitudeofEPSCinthalamicneurons.Inaddition,VGLUT2deficiencyinDRG-conditionedknockoutmiceattenuatesthermalallodynia,butnotmechanicalallodynia.ThesestudiessuggestthatVGLUT2isassociatedwithpain,especiallyneuropathicpain,butitsroleinthalamus,spinalcordandDRGmaybedifferent.Previously,wealsodemonstratedthatVGLUT2expressionissignificantlyupregulatedinspinalcordandsomesupraspinalregionsincludingthalamus,andChicagoSkyBlue6B(CSB6B),aVGLUTinhibitor,inhibitssparednerveinjury(SNI)inducedglutamatereleaseandmechanicalallodynia.However,theinhibitoryeffectsofCSB6BarenotselectiveamongVGLUTisoformsandthespecificroleofVGLUT2inpainregulationishardtobedissected.Ontheotherhand,theexpressionalregulationmechanismofVGLUT2remainsunknown.SomestudiesreportedthatWnt/β-cateninsignalingpathwayregulatesthefunctionofglutamatergicneurotransmission;meanwhile,classicalandnonclassicalWntsignalingpathwayplaysanimportantroleinneuropathicpain.Therefore,onlythosequestionsareidentified,1)HowdoestheexpressionofVGLUT2changeduringthedevelopmentofneuropathicpain?2)WhataretheeffectsofVGLUT2interferenceonneuropathicpain?3)WhethertheroleofWnt/β-cateninsignalinginneuropathicpainisconductthroughVGLUT2?ThenitwillprovidenecessarytheoreticalbasisfordeterminingwhetherVGLUT2canbeatargetforthetreatmentofneuropathicpain.ObjectiveThepurposeofthisstudyistofurtheridentifythecorrelationbetweenVGLUT28 军事科学院博士学位论文andneuropathicpain,andtoinvestigatetheroleofWnt/β-cateninsignalinginVGLUT2expressionalregulationandneuropathicpain.MethodsToelucidatetheassociationbetweenVGLUT2andneuropathicpain,wedeterminedtheexpressionandcelldistributioncharacteristicsofVGLUT2underpathologicalconditionsfirstly,thendevelopedtwolentivirusenvelopedVGLUT2targetingshRNAanddeliveredthemrespectivelyintospineorVPLofthalamustostudytheroleofVGLUT2inneuropathicpainandglutamaterelease.Finally,weinvestigatedtheeffectofWnt/β-cateninsignalingonVGLUT2proteinexpressionandpainbehaviorbyusingWntagonistandinhibitorinanimalswithneuropathicpain.1.ChangesofVGLUT2expressioninspinalcordafterneuropathicpainThemiceSNImodelwasusedtosimulatetheneuropathicpaincausedbyneurotraumainclinic.VonFreyfilamentswereusedtotestthechangesofmechanicalthresholdinthelateralplantarsurfaceoftheinjuredhind-paw(thesuralnerveinnervationarea).Aftersuccessfulestablishmentofthemodel,theexpressionofVGLUT2proteininspinalcordwasdetectedbyWesternblottingandimmunohistochemistry.Immunofluorescencedoublelabelingwasalsousedtoobservetheco-localizationofVGLUT2withneurons(NeuN,MAP2),microglia(IBA1)andastrocyte(GFAP)tostudythedistributionofVGLUT2indifferenttypesofcellsinthespinaldorsalhornofmiceafterneuropathicpain.2.Theeffectoflentivirus-shRNA-VGLUT2onneuropathicpainandglutamatereleaseTakeadvantageoftheInvitrogenBLOCK-iT™RNAiDesignerWebsite,threeVGLUT2shRNAinterferencesequencesweredesigned,andthenpackagedintolentivirusplasmid.Thelentivirus-shRNA-VGLUT2wastransfectedintoprimaryculturedneuronstodetecttheeffectofshRNA-VGLUT2onVGLUT2gene,proteinexpressionandglutamaterelease.Validatedlentiviral-shRNA-VGLUT2wasinjectedintotheVPLofthethalamusorspinalcordon7daybeforeor4dayafterSNIoperation,andmechanicalthresholdwasdetected.SynaptosomesfromspinalcordandVPLwereextracted7daysafterSNI,anddepolarizationinducedglutamatereleasewasdetected.3.ChangesofWnt/β-cateninsignalingpathwayanditsroleintheregulationofVGLUT2expressioninneuropathicpainTheeffectofβ-cateninover-expression,Wnt3aorXAV939treatment(Wnt/β-cateninsignalingpathwayinhibitor)ontheexpressionofVGLUT2proteinwasobservedinPC12cells.TheeffectsofintrathecalinjectionofWntagonistsorXAV939ontheexpressionofVGLUT2proteinwereobservedinmice.TostudytheregulatorymechanismofVGLUT2expressioninpathological9 军事科学院博士学位论文condition,wefirstdetectedtheexpressionofWntfactorandβ-cateninproteininspinalcordatdifferenttimepoints(1,4,7,14,21days)afterSNI.InordertoinvestigatewhetherWnt/β-cateninpathwayregulatestheexpressionofVGLUT2anditsroleinneuropahticpainbehavior,1)XAV939wasintrathecaladministered7daysafterSNIsurgery,whenVGLUT2proteinwassignificantlyup-regulated.ThechangeofmechanicalthresholdandtheexpressionofVGLUT2proteinweredetermined;2)theeffectsofWntagonistorWnt1onmechanicalthresholdswereobserved14daysaftershRNA-VGLUT2administration.Results1.ChangesofVGLUT2proteinexpressionandcelltypelocationinspinalcordatdifferenttimepointsafterSNIThewesternblotresultsshowedthattheSNIsurgeryinducedsignificantchangesintheexpressionofVGLUT2protein(F[6,36]=6.249,p<0.0001).TheexpressionofVGLUT2proteinincreasedsignificantlyonpostoperativeday7,day14andday21comparedwiththenaiveanimals,whichincreasedfor31%±9%(p<0.05),33%±11%(p<0.05),27%±7%(p<0.05)respectively.TheresultsofimmunohistochemistryindicatedthatVGLUT2inthespinalcordincreasedsignificantly14daysafterSNI(p<0.05).DoubleimmunofluorescencelabelingofVGLUT2withfourkindsofcellmarkers(NeuN,MAP2,IBA1andGFAP)showedthatVGLUT2wasmainlyexpressedinneuronsinthedorsalhornofthespinalcordafterSNI(NeuN,MAP2).2.TheeffectoflentivitiralshRNA-VGLUT2onneuropathicpainandthereleaseofglutamate2.1ValidationofshRNAsequencesagainstVGLUT2andshRNA-VGLUT2affectsglutamatereleaseinprimaryculturedneuronsThelentiviral-envelopedshRNA-VGLUT2wastransfectedintoprimaryculturedneurons.Tendaysaftertheinfection,theVGLUT2mRNAlevelsweresignificantlydownregulatedinallshRNA-treatedcellswhileproteinlevelswereefficientlyaffectedincellstreatedwithshRNA-1andshRNA-2.TheshRNA-1decreasedtheVGLUT2mRNAandproteinto16%±1.5%and43%±10.3%respectivelyandshRNA-2decreasedtheVGLUT2mRNAandproteinto13%±1.5%and20%±5.1%respectively.TheresultsofextracellularglutamatereleasefromlentiviralshRNA-VGLUT2pre-treatedprimaryculturedneuronsshowthatshRNA-1(33.82±0.66µMvs.20.39±1.17µM,p<0.05)andshRNA-2(33.82±0.66µMvs.18.97±1.09µM,p<0.05)significantlydecreasedtheextracellularglutamatereleasefromprimaryculturedneuroncomparedwithshRNA-Sc.2.2Theeffectoflentivirus-shRNA-VGLUT2onmechanicalthresholdofmicebeforeorafterSNIandtheglutamatereleasefromsynaptosomes10 军事科学院博士学位论文IntrathecaladministrationofshRNA-VGLUT2doesnotaffectthebasalmechanicalthresholdofmice.IntrathecaladministrationofshRNA-VGLUT27daysbeforesurgerysignificantlydecreasedSNIinducedallodynia(F[5,168]=261.78,p<0.0001),andtherewassignificantdifferenceon4,7,10,14dayafteroperation.Inanotherexperiment,intrathecaladministrationofshRNA-VGLUT24daysafteroperationsignificantlydecreasedSNIinducedallodynia(F[5,168]=367.28,p<0.0001),andtherewassignificantdifferenceon7,10,14dayafteroperation.MicroinjectionofshRNA-VGLUT2intoVPL7daysbeforesurgerysignificantlydecreasedSNIinducedallodynia(F[5,164]=316.4,p<0.0001),andtherewassignificantdifferenceon4,7,10,14dayafteroperation.Inanotherexperiment,MicroinjectionofshRNA-VGLUT2intoVPL4daysafteroperationsignificantlydecreasedSNIinducedallodynia(F[5,164]=284.93,p<0.0001),andtherewassignificantdifferenceon7,10,14dayafteroperation.GlutamatereleasefromspinalsynaptosomesissignificantlyincreasedbySNIsurgerycomparedwithnormalanimals(7.34±0.42nmol/mgvs.11.94±0.57nmol/mg,p<0.05).IntrathecalinjectionofshRNA-VGLUT2significantlyreducedtheamountofglutamatereleaseinthespinalsynaptosomesofSNIanimals(p<0.05).MicroinjectionofshRNA-VGLUT2intheVPLofthethalamussignificantlyreducedtheamountofglutamatereleasedfromVPLsynaptosomes(8.12±0.24nmol/mgvs.7.31±0.21nmol/mg,p<0.05).3.TheeffectofneuropathicpainontheexpressionofWnt/β-cateninsignalingpathwayanditsroleintheregulationoftheexpressionofVGLUT23.1ChangesinexpressionofWnt/β-cateninsignalingpathwayafterSNIAfterSNI,Wnt1mRNA(F[2,12]=11.45,p<0.0001),Wnt1protein(F[2,10]=9.279,p<0.001)andβ-cateninprotein(F[3,15]=6.312,p<0.001)changesignificantly.Wnt1mRNAincreasedsignificantlyonthe7,14,21dayafteroperation(p<0.05),Wnt1proteinincreasedsignificantlyon1,4,7,14and21daysafteroperation(p<0.05),andβ-cateninproteinincreasedsignificantlyat1,4,7,14and21daysafteroperation.Onthe14dayafterSNI,theexpressionofβ-cateninproteinincreasedsignificantlyinthefrontalcortex,whiletheβ-catenininthenucleusaccumbensandamygdaladecreasedsignificantly,whiletheβ-catenininhippocampusandthalamusdidnotchange.3.2TheeffectofWnt/β-catenin,BDNFsignalingpathwayontheexpressionofVGLUT1andVGLUT2proteinInPC12cells,β-cateninoverexpressionorWnt3atreatmentincreasedthe11 军事科学院博士学位论文proteinlevelofVGLUT1andVGLUT2,whileXAV939treatmentreducedVGLUT1andVGLUT2proteinexpression.Inanimals,intrathecaladministrationofWntagonistorWnt1significantlyincreasedtheexpressionlevelofVGLUT2proteininthespinalcord.IntrathecaladministrationofXAV939significantlydecreasedtheexpressionlevelofVGLUT1andVGLUT2proteininspinalcord.IntrathecalinjectionofBDNFsignificantlyincreasedtheexpressionlevelofVGLUT1,VGLUT2,andβ-cateninproteininspinalcord.3.3RegulationoftheexpressionofVGLUT2proteinbyWnt/β-cateninsignalingpathwayanditseffectonpainbehaviorIntrathecaladministrationofXAV9397daysafterSNIsignificantlyaffectedmechanicalallodyniainmice(F[2,108]=401.05,p<0.0001).After2h,theanimalmechanicalthresholdbegantorise,andthemaximumvaluewasreachedafter6h(0.522±0.071gvs.0.044±0.015g,p<0.01).After12h,thethresholdrestoredtothelevelbeforeadministration.DetectionofproteinexpressionreveledthattheexpressionofVGLUT2andβ-cateninwassignificantlylowerthanthatinthecontrolgroupafter6hoftreatment,aloughttheexpressionlevelofβ-cateninwasstillatadecreasinglevel,VGLUT2proteinreturnedtothelevelofbeforeadministrationafter6hoftreatment.Innormalanimals,intrathecalinjectionofWntagonistdecreasedthemechanicalthresholdat3,6,9,and12hafteradministration,whileshRNA-VGLUT2significantlycounteractedWntagonistsinducedmechanicalallodynia(F[3,84]=10.56,p<0.001).IntrathecaladministritionofWnt1decreasedthemechanicalthresholdat3,6,9,and12hafterinjectioninmormalmice,whileshRNA-VGLUT2significantlycounteractedWnt1inducedmechanicalallodynia(F[3,96]=38.21,p<0.0001).ConclusionTheVGLUT2expressionincreasedafterSNIsurgeryinthemicespinalcord,andshRNA-VGLUT2attenuatedtheSNI-inducedmechanicalallodynia.ThissuggestedthatVGLUT2isanimportantmoleculeinvolvedinthedevelopmentofneuropathicpain.TheroleofVGLUT2onpainisduetoitsinhibitionofglutamaterelease.Undertheconditionofneuropathicpain,theWnt/β-cateninsignalingpathwayregulatedtheexpressionofVGLUT2protein,andthisregulationwascloselyrelatedtoneuropathicpainbehavior.12 军事科学院博士学位论文Keywords:VGLUT2;neuropathicpain;RNAinterference;Wnt/β-cateninsignaling13 军事科学院博士学位论文前言第一部分VGLUT2在神经病理性痛中的作用慢性痛越来越成为危害人类身心健康的重要疾病。据统计，美国有1.16亿成年人遭受慢性痛的折磨，每年花费在慢性痛上的医疗费用远远超出心血管疾病、[1][2]癌症和糖尿病三种疾病的总花费，在欧洲每五个人就有一人患慢性痛。神经病理性痛是指由于传入神经、脊髓或中枢神经系统等部位受到损伤而引起的疼痛[3]综合症，是一类十分重要的慢性疼痛。神经病理性痛不仅引起痛觉感受、传递系统一系列结构和功能的改变，同时伴随其它神经系统功能紊乱，例如睡眠障碍、抑郁样行为以及认知功能下降，使患者的身心健康及生活质量受到极大影响。神经痛的发病机制十分复杂，虽然大量文献报道免疫、神经递质、离子通道等参与神经痛的发生发展过程，但各类影响因素的重要性仍无定论，临床仍然缺乏有效[4-6]的治疗药物。因此，深入研究神经病理性痛的发病机制具有重要的理论及现实意义。谷氨酸在哺乳动物神经系统中广泛分布，是最为重要的兴奋性神经递质。研究表明，谷氨酸信号系统在痛觉信息传导及整合中具有重要的作用，与多种类型的疼痛密切相关。神经痛动物的中枢神经系统谷氨酸释放增加，减少谷氨酸的释[7]放能够有效缓解动物的疼痛症状。近年来，以谷氨酸递质系统为靶标的药物研究取得了一些进展。NMDA受体拮抗剂氯胺酮以及MK-801可以通过抑制NMDA[8]受体活性进而提高动物的疼痛阈值，糖皮质激素受体拮抗剂可以显著下调NMDA受体的表达起到减轻疼痛的作用，I型代谢型谷氨酸受体拮抗剂（S）[9]-ACPG能显著降低痛敏感性，β-内酰胺克拉维酸能够提高谷氨酸转运体GLT1[10]的表达进而缓解神经病理性痛。然而，这些药物往往存在严重的副作用，因此深入研究神经痛过程中的谷氨酸能机制，对发现新的镇痛靶标具有重要意义。突触间隙的谷氨酸浓度依赖于谷氨酸释放和清除速率。突触前神经元中谷氨酸被转运到囊泡中进行释放，释放到突触间隙的谷氨酸主要依赖于位于质膜上的谷氨酸转运体（excitatoryaminoacidtransporters，EAATs）进行清除。突触前膜谷氨酸的释放是以胞吐的形式进行的，突触终末的谷氨酸在释放之前要先转运到囊泡中储存，囊泡谷氨酸转运体（vesicularglutamatetransporters，VGLUTs）正[11]是承担谷氨酸囊泡转运中的蛋白。目前已知的VGLUTs包括VGLUT1,[12]VGLUT2和VGLUT3。在中枢神经系统中，VGLUT1和VGLUT2以互补形式[13-16]分布于几乎所有的谷氨酸能神经元中，实际上VGLUT1和VGLUT2已被广14 军事科学院博士学位论文泛用作谷氨酸能神经元的标志。而VGLUT3主要表达于胆碱能等非谷氨酸能神[17-19]经元中。图1突触间隙谷氨酸循环转运及代谢越来越多的研究提示VGLUTs，尤其是VGLUT2在慢性痛的发生发展中扮演着重要的角色。首先，VGLUT2广泛分布于背根神经节（dorsalrootganglion，[13-15,20,21]DRG）、脊髓、丘脑和脑干等伤害性感受传导通路的重要组成部分；其次，VGLUT2缺陷的杂合子动物或DRG条件性敲除VGLUT2动物在神经病理[20,22,23]性痛条件下的疼痛阈值显著高于对照组动物；本实验室前期研究发现，在坐骨神经分支选择性损伤（sparednerveinjury，SNI）这一神经病理性痛模型小鼠中，丘脑等与疼痛密切相关脑区中VGLUT2蛋白表达显著上升，脑室给予[24]VGLUTs抑制剂ChicagoSkyBlue6B（CSB6B）显著抑制SNI所致的机械痛敏。但是，CSB6B的抑制作用并不具有VGLUT亚型选择性，因此VGLUT2与神经病理性痛的相关性有待进一步探究。图2VGLUTs在脑内的表达分布第二部分VGLUT基因干扰技术的研究目前尚无特异性针对某一VGLUT亚型的激动剂和抑制剂，因此VGLUT各亚型的生理功能及其在不同病理条件下的作用仍未阐明。基因技术的发展为针对某一特定蛋白质的研究工作提供了新的思路。2004年Fremeau和Wojcik两个实验室报道了VGLUT1基因敲除小鼠研究结果：VGLUT1全基因敲除小鼠出生后15 军事科学院博士学位论文[25,26][23]三周死亡；2006年Moechars等报道VGLUT2全基因敲除小鼠死于临产期，以上研究提示VGLUT1和VGLUT2分别在动物早期生长和胚胎发育中发挥了至关重要的作用。分别从VGLUT1和VGLUT2的全基因敲除胎鼠中分离得到的突触囊泡揭示VGLUT1和VGLUT2决定了谷氨酸的量子式释放，而杂合子动物研究表明VGLUT1或VGLUT2分别调控了不同行为学。但是，这对于进一步的VGLUTs研究工作还远远不够，因为整体敲除不能够揭示具体是哪个部位或者神经环路的VGLUT起到了关键性的作用，且整体敲除引起的代偿反应使得敲除动物与正常生理或病理条件下的动物存在较大差别。为揭示特定脑区或神经环路中VGLUTs对生理病理过程的影响，研究者又构建了一系列条件性VGLUT敲除动[27]物。2007年，Tong等首次获得了腹内侧下丘脑VGLUT2敲除的小鼠，发现VGLUT2在血糖调节中的重要作用；2009年，Wallen等获得了青春期小鼠皮层、[28]杏仁核以及海马VGLUT2敲除的动物，进而对VGLUT2在认知、情绪和社交行为方面的作用进行了研究；2010年，Birgner等得到了腹侧被盖区VGLUT2敲[29]除的小鼠，证明了腹侧被盖区内VGLUT2表达的多巴胺能神经元在正常的情绪反应以及兴奋剂所致的高活动性中的作用。在疼痛相关研究领域，2010年，Basbaum研究团队敲除了小鼠伤害性感受器以及DRG中的VGLUT2，发现动物[21]的热痛阈、机械痛阈和化学痛阈值显著升高，且对损伤所致的热痛敏显著减轻。随后，又有研究者进一步敲除DRG中辣椒素受体1（TRPV1）以及Nav1.8阳性[30-32]神经元上的VGLUT2，发现VGLUT2在疼痛和痒感觉中发挥关键作用。然而，目前为止没有针对脊髓的VGLUT2条件性敲除动物的报道。RNA干扰（RNAinterference，RNAi）是由两种小的单链RNA分子（smallinterferingRNAs，siRNAs和microRNAs，miRNAs）介导的转录后基因沉默机制，[33]广泛存在于真核生物中。RNAi现象于1998年首次由Fire发现。基于其能够快速并且特异性地将某个基因的表达进行抑制，因此成为一种替代基因敲除的有效工具。2002年，科学家首次将RNAi技术运用到了哺乳动物的原代培养的神[34]经元中。2004年，科学家通过鞘内注射的方法将疼痛相关的阳离子通道P2X3的siRNA给到了DRG中并显著缓解动物的神经病理性痛症状。这是首次将RNAi技术运用到了疼痛的研究中，为研究疼痛的机制以及疼痛的治疗提供了新的思路[35]。然而最初的RNAi技术存在的严重缺陷是需要持续给予大剂量siRNA。一种更为有效的替代方法是通过病毒载体将短发卡RNA（smallhairpinRNA，shRNA）带入宿主体内进而通过shRNA产生的siRNA对相应的基因进行干扰。2008年，Anesti等利用改构过的单纯疱疹病毒（HSV-1）将针对TRPV1的shRNA在DRG[36]进行了表达，并验证了其有效性。在本研究中，我们采用选择性干扰的方法16 军事科学院博士学位论文研究了VGLUT2对神经病理性痛的调控作用及机制。第三部分VGLUT表达调控机制研究目前，有关VGLUT表达调控机制的研究还很少。BDNF与突触可塑性相关，[37]不仅调控可塑性相关的AMPA和NMDA受体表达，还促进突触蛋白synapsin[38,39]I磷酸化、增加囊泡在突触活性带的停驻时间从而促进谷氨酸量子式释放。基于这些结果，有研究者对BDNF信号通路是否能够调控VGLUT表达进行了研究，结果显示在原代培养7天的海马神经元中，外源性BDNF剂量依赖性增加VGLUT2的mRNA和蛋白表达，也能短时增加VGLUT1的表达；但是，在原代培养14天的海马神经元中，外源给予BDNF能够稳定增加VGLUT1的表达而并[40]不影响VGLUT2的表达，且这一作用是由TrkB-PLCγ信号通路介导的。另有研究报道，在原代培养大鼠DRG神经元中，外源给予BDNF同样能通过PLCγ[41,信号通路上调VGLUT3的蛋白表达，而且与转录因子Etv4和Etv5的激活有关42]。另有研究发现，在组织损伤的大鼠DRG中，mTOR信号通路能够调控VGLUT2的蛋白表达，首先组织免疫荧光结果显示p-mTOR与VGLUT2表达具[43]有共定位现象，其次抑制mTOR信号通路能够下调VGLUT2蛋白表达。有些研究者以研究VGLUT1与VGLUT2功能差异为目的，对二者的相互作用蛋白进行了研究。谷氨酸能神经递质的囊泡转运主要依赖于VGLUT1和2，二者决定了谷氨酸的储存与释放。虽然二者在突触体囊泡的谷氨酸摄取实验中表现出了基本相似的转运活性：1）二者转运谷氨酸的原始动力都来源于氢离子浓度差所形成的膜势能；2）二者对谷氨酸的转运都具有特异性，并不转运天冬氨酸和谷氨酰胺这些与谷氨酸结构与性质相似的氨基酸；3）对谷氨酸的转运都是---Cl依赖的，在低浓度的Cl情况下VGLUT几乎没有转运活性，高浓度的Cl能够[44]激活VGLUT转运活性。但它们在个体发育过程中的表达分布变化以及在成年[25,45]个体中互补性的表达分布特点，提示它们在功能上可能有所差异。研究证[46,47]明，二者的膜定位方式不一样，说明它们转运的谷氨酸具有各自的释放特点。VGLUT1和VGLUT2的氨基酸序列同源性高达80%，二者的序列差异主要体现在N末端和C末端，它们的C末端都含有dileucine样的定位结构域和富含的脯氨酸，谷氨酸，丝氨酸苏氨酸PEST结构域，只有VGLUT1含有两个多聚脯氨酸结构域和一个易发生磷酸化修饰的酸性氨基酸序列；VGLUT1上的多dileucine[46,48,样定位结构域通过与不同的网格编辑蛋白相互作用能走向不同的循环道路49]，VGLUT1的多聚脯氨酸结构域与含有SH3结构域的蛋白相互作用能使VGLUT1在调控谷氨酸释放的时候具有更快的循环周期。有文章报道，VGLUT1[50]能够与AIP4、Nedd4等泛素链接酶发生相互作用，说明翻译后修饰很有可能17 军事科学院博士学位论文在VGLUT的表达调控中具有重要的意义。虽然，其中很多蛋白的相互作用的生物学意义还有待进一步研究，但至少为我们研究VGLUT的分子机制提供了很有[51]价值的依据。此外，有研究提示VGLUT可能受microRNA分子的调控。有关VGLUT2相互作用蛋白的研究目前基本没有，那么调控VGLUT2的分子机制是什么呢？在神经病理性痛等病理条件下VGLUT2表达调控的分子机制又将发生怎样的变化呢？第四部分Wnt/β-catenin信号通路对谷氨酸能信号系统相关蛋白调控的研究基于Wnt/β-catenin信号通路在神经病理性痛中的作用已有报道及其对谷氨酸能信号通路蛋白的表达及功能调控的研究，我们推测Wnt/β-catenin信号通路可能参与VGLUT蛋白的表达调控。Wnts是高度保守的分泌型糖蛋白，通过自分泌或旁分泌作用于质膜上不同受体进而激活不同的下游信号通路。Wnt/β-catenin信号通路是经典的Wnt信号通路，当细胞未被Wnt信号刺激时β-catenin被APC/Axin/GSK-3β降解复合物降解而在胞质中维持较低的水平，当胞外Wnts因子与胞膜Frizzled（Fz）蛋白和低密度脂蛋白相关蛋白5/6（lowdensitylipoproteinreceptorrelatedprotein5/6，LRP5/6）受体结合后，细胞质中的Dvl蛋白将会被募集到细胞膜上，被Fz激活的Dvl将导致GSK-3β蛋白活性受抑制，使得β-catenin免于被磷酸化而进入泛素蛋白酶体降解途径，浓集的β-catenin从细胞质进入到细胞核，与T细胞因子/淋巴因子增强子（TCF/LEF）结合形成转[52,53]录因子复合物调节下游靶基因的表达。在中枢神经系统中，Wnt/β-catenin信号通路在记忆巩固、神经发生、神经递质释放和长时程增强（1ong-termpotentiation，LTP）及长时程抑制（long-termdepression，LTD）而导致的神经突触可塑性改变等各种神经活动中起到了非常[54,55]重要的作用。越来越多的研究表明Wnt/β-catenin信号通路与谷氨酸能信号系统密切相关。2012年，有研究者利用基因芯片发现下调人祖星型胶质细胞[56]（PDAs）中的β-catenin能够影响谷氨酸神经传递相关蛋白的表达。他们继而发现在PDAs中用siRNA干扰β-catenin的表达能够抑制兴奋性氨基酸转运体2（excitatoryaminoacidtransporter2，EAAT2）和谷氨酰胺合成酶（Glutaminesynthetase，GS）的表达，而转染含有β-cateninDNA序列的质粒能够增加星型胶质细胞膜上EAAT2和GS的mRNA及蛋白表达，luciferase报告实验和ChIP实验证实这种调控是β-catenin与TCF-1或TCF-3构成的转录因子复合物在转录水[57]平直接的调控作用结果。另有研究报道，在采用6-羟基多巴胺处理得到的帕金森病细胞模型多巴胺能SH-SY5Y细胞中，外源性Wnt1蛋白可通过激活Wnt/β-catenin信号通路升高谷氨酸转运体GLT1和GLAST的表达，提示18 军事科学院博士学位论文Wnt/β-catenin信号通路可调节谷氨酸转运体表达从而抑制兴奋性氨基酸毒性而[58]发挥细胞保护作用。突触连接的形成、维持和可塑性变化是由各种各样的蛋白分子以及电信号分子所调控的，β-catenin是其中非常重要的一个蛋白分子，因为β-catenin能够调控钙粘蛋白所介导的细胞黏附和决定突触活性的突触前后膜蛋白分子的募集。在突触形成及发生可塑性变化的过程中，N钙粘蛋白在膜上的分布情况是与其跟β-catenin的相互作用密切相关的，β-catenin通过α-catenin将[59]N钙粘蛋白连接到细胞骨架上，它们之间的相互作用在突触前膜体现为增加突[60]触囊泡的聚集，在突触后膜体现为募集支架蛋白PSD95和AMPA受体亚基[61]GluA2到突触上去。在海马神经元中，β-catenin的膜转位以及TCF/LEF依赖[62]的基因能够影响NMDA受体的活性。研究发现，在杏仁核中抑制GSK3β能够增加β-catenin的蛋白表达进而减弱NMDA受体所介导的谷氨酸能突触的LTD[63]和去增强DPT。有研究报道，在成年的视觉皮层兴奋性神经元中，抑制β-catenin蛋白并不会改变突触前动作电位的产生，也不会使mEPSCs发生变化，但是会显[64]著影响NMDA电流。以上研究表明Wnt/β-catenin信号通路与谷氨酸能信号通路特别是与神经突触可塑性密切相关的NMDA受体的表达以及定位密切相关，这就提示Wnt/β-catenin信号通路可能与决定突触谷氨酸释放的VGLUT2的表达调控有关。2013年，宋学军研究团队首次报道了Wnt/β-catenin信号通路参与神经病理[65]性痛的发病机制，发现在大鼠神经痛慢性压迫损伤（chronicconstrictioninjury，CCI）模型中，Wnt3a、β-catenin和磷酸化的NMDA受体亚基NR2B表达在脊髓中显著上升，而用Fc-8/Fc抑制Wnt信号通路能够显著下调p-NR2B蛋白表达。随后有研究报道，在小鼠坐骨神经部分损伤模型（partialsciaticnerveligation，[66]PSL）中脊髓Wnt3a通过激活小胶质细胞参与神经病理性痛。神经病理性痛成因多样、机制复杂，那么Wnt/β-catenin信号通路是否参与其它类型的神经病理性痛？综上所述，虽然已知VGLUT2与神经病理性痛有关，调控Wnt/β-catenin信号通路能影响谷氨酸能受体与神经突触可塑性变化，但尚不清楚在成年动物中特异性干扰VGLUT2对神经病理性痛的影响？病理条件下Wnt/β-catenin信号通路除了经典作用机制外是否还存在新的作用机制？是否通过调控VGLUT2表达而影响神经痛的发生发展？19 军事科学院博士学位论文图3Wnt/β-catenin信号通路模式图本课题为进一步阐明VGLUT2与神经病理性疼痛的相关性，对SNI术后脊髓VGLUT2蛋白表达变化进行了研究，进而通过构建特异性靶向VGLUT2的shRNA慢病毒载体，研究了选择性下调丘脑或脊髓VGLUT2蛋白对神经病理性痛行为的影响，最后为揭示VGLUT2的表达调控机制，探讨了Wnt/β-catenin信号通路对VGLUT2蛋白表达调控的影响及与疼痛行为的相关性。20 军事科学院博士学位论文第一部分神经痛模型动物脊髓VGLUT2表达变化脊髓是痛觉传递过程中最先经过的中枢神经系统部位，从初级感觉神经纤维传递过来的伤害性痛觉信号在脊髓进行整合、放大之后传导给大脑中枢。目前研究已经证实脊髓中痛觉神经元的过度兴奋所导致的突触可塑性变化是引起神经病理性痛的主要原因，谷氨酸作为脊髓中最为重要的兴奋性神经递质，在其中起到了关键性的作用。在SCI动物中，脊髓细胞外的谷氨酸浓度升高了37倍，高[67]浓度的谷氨酸将激活谷氨酸受体所介导的下游信号通路，进而引起中枢敏化。免疫标记研究结果显示，VGLUT2广泛分布于脊髓的各个板层，其中在接收C纤维传入的板层II中表达量最高，而且这一板层也是兴奋性中间神经元表达最[68]为集中的部位。这些研究均提示脊髓中的VGLUT2可能在神经病理性痛的发生发展过程中发挥了重要作用。本研究中，我们采用起效时间短、动物行为学表现稳定、持续时间长的小鼠坐骨神经分支选择性损伤（SNI）模型，利用蛋白免疫印迹和免疫组化的方法检测了SNI术后不同时间点脊髓VGLUT2的蛋白表达变化，阐述VGLUT2在神经病理性痛的发生发展中的动态变化。由于近年来胶质细胞在疼痛中的作用越来越被研究者所重视，因此我们采用免疫荧光双重标记的方法检测了SNI术后脊髓VGLUT2与神经元标志物NeuN和MAP2及神经胶质细胞标志物GFAP和IBA1的细胞共定位情况。1实验材料1.1实验动物C57BL/6小鼠，雄性，7-8周龄，购自斯贝福（北京）实验动物科技有限公司，SPF级动物，动物合格证号：SCXK（京）2016-0002，每只笼子放置5-6只，饲养环境恒温恒湿，日光灯每12h明暗交替，自由摄食饮水。SD大鼠，雄性，24h新生，购自斯贝福（北京）实验动物科技有限公司，SPF级动物，动物合格证号：SCXK（京）2016-0002。1.2PC12细胞株大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤。细胞培养液的配方为：10%胎牛血清、10%马血清的DMEM培养液，在37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。1.3细菌菌株和质粒1.3.1细菌菌株大肠杆菌DH5α感受态细胞购自天根生物公司。1.3.2pcDNA3.1/myc-His载体21 军事科学院博士学位论文用于构建VGLUT2真核表达质粒，Neomycin筛选抗性，购自Invitrogen公司。图4pcDNA3.1/myc-His载体示意图1.4实验试剂1.PC12细胞培养试剂Dulbecco’smodifiedEaglemedium(DMEM)GIBCOfetalbovineserum(FBS)ExCellBioheat-inactivatedhorseserum(HS)Hyclonpenicillin/streptomycinHyclone0.15%胰蛋白酶MPBiomedicals2.细胞转染试剂Opti-MEMGIBCOLipofectamine2000invitrogenLipofectamineRNAiMaxinvitrogen3.分子生物学试剂2xEsTaqMasterMix康为世纪EcoRⅠ、XhoⅠ限制性核酸内切酶FermentasT4DNA连接酶Fermentas普通质粒小提试剂盒天根去内毒素小提试剂盒OMEGA22 军事科学院博士学位论文DNA回收及纯化试剂盒天根DNAmarker天根DNAloading天根氨苄青霉素AmpicillinSigma琼脂糖Biowest全式金EB染料类似物4.蛋白检测所需试剂30%聚丙烯酰胺溶液普利莱过硫酸铵AP普利莱TRISAmrescoSDSSigma甘氨酸GlycineAmrescoTEMED普利莱PVDF膜Millopore吐温20国药集团脱脂奶粉BD蛋白酶抑制剂RocheRIPA裂解液普利莱5XSDSloading普利莱BCA蛋白浓度测定试剂盒普利莱蛋白MarkerFermentas显影液Millipore5.SNI手术所需试剂生理盐水石家庄四药75%消毒酒精捷利康碘伏捷利康戊巴比妥钠Sigma注射用青霉素钠粉末华北制药6.免疫组化及免疫荧光试剂生理盐水石家庄四药23 军事科学院博士学位论文4%多聚甲醛普利莱肝素江苏万邦生化医药公司戊巴比妥钠美国Sigma蔗糖国药集团OCT包埋剂SAKURA无水乙醇国药集团二甲苯国药集团柠檬酸（PH6.0)抗原修复液ServicebioBSAServicebio苏木素染液Servicebio苏木素分化液Servicebio苏木素返蓝液Servicebio中性树胶Servicebio组化试剂盒DAB显色剂Servicebio7.主要抗体VGLUT2抗体（蛋白免疫印迹）CST,71555（1:1000）VGLUT2(免疫组化)Abcam,ab79157（1:300）VGLUT2（组织免疫荧光）Abcam,ab72310（1:100）GAPDH普利莱（1:1000）NeuNServicebio,GB13138（1:200）MAP2Abcam,ab11267（1:100）GFAPAbcam,ab53554（1:100）IBA1Abcam,ab5076（1:100）DAPIServicebio,G1012（1:3000）1.5主要仪器及设备仪器公司或品牌VonFrey纤维丝Danmic/USA眼科剪、弯镊、持针器等德国Leica二氧化碳培养箱美国Thermo公司恒温循环水浴锅CFYQYB公司24 军事科学院博士学位论文TissuelyserⅡ高通量组织研磨仪Qiagen光学显微镜Olympus公司-70℃冰箱日本三洋公司台式高速冷冻离心机德国艾本德公司CM1850型冷冻切片机Leica垂直电泳仪以及电转移槽BioRad公司水平电泳仪BioRad公司电子天平德国Sartorius公司酶标仪MolecularDevices灌流器LongerPump发光成像分析仪FUJIFILM公司移液枪Gillson2实验方法2.1试剂配方溶液名称配制方法PC12细胞培养基配置DMEM10%FBS10%HS5,000units/mlpenicillin/streptomycin10×PBS2gKCl2gKH2PO480gNaCl22.5gNa2HPO4至1LddH2O0.15%胰蛋白酶0.15%胰蛋白酶137mMNaCl5.4mMKCl0.37mMNa2HPO4·12H2O0.44mMKH2PO425 军事科学院博士学位论文4.2mMNaHCO30.54mMEDTA·2Na10×SDS-PAGE跑胶缓冲液30.2gTris188g甘氨酸10gSDS至1LddH2O配制1×SDS-PAGE跑胶缓冲液：100ml10×SDS-PAGE跑胶缓冲液+900mlddH2O10×转膜缓冲液30gTris144g甘氨酸至1LddH2O配制1×转膜缓冲液：100ml10×转膜缓冲液+200ml甲醇+700mlddH2O。1×PBST洗膜缓冲液1L1×PBS加入1mlTween-20LB细菌培养基2g胰蛋白栋1g酵母提取物2gNaCl200mlddH2O3g琼脂（固体培养基才加）121℃，灭菌20min50×TAE电泳缓冲液121.1gTris18.6gNa2EDTA4gNaOH至500mlddH2O，调pH8.5配制1×TAE电泳缓冲液：20ml50×TAE电泳缓冲液+980mlddH2O2.2机械痛阈测定(1)适应环境：将小鼠置于铁丝网上，用开口向下的透明塑料筐分别将小鼠固定在框内，框的大小要保证动物有足够的活动空间。测试前让动物在此环境中适应3-4次，每次适应15-20min；(2)运用不同粗细的Von-Frey纤维丝（正常动物从0.6g开始，手术后的动物从26 军事科学院博士学位论文0.16g开始）透过铁丝网从垂直于脚掌的方向刺激小鼠左后侧足外侧跖面。每次检测要使纤维丝弯折到90度角后停留5s，观察小鼠在此时间内是否会出现缩足、舔足和抬足等疼痛反应；(3)如果动物出现疼痛反应，则换用相邻更小折力的纤维丝；(4)如果动物无缩足等疼痛反应，则换用相邻更大折力的纤维丝；(5)按上述原则依次交替进行测定，待第一次出现阳、阴（或阴、阳）反应交替值之后，再连续测定4次；[69](6)最后运用up-and-down方法计算出动物的机械痛阈值。2.3坐骨神经分支选择性损伤（SNI）模型构建[70]本实验所用SNI神经病理性痛模型参照Decosterd和Woolf的方法建立：(1)小鼠称重后，用40mg/kg戊巴比妥钠对小鼠进行腹腔注射麻醉；(2)用镊子轻夹动物脚掌或尾尖确认麻醉成功之后，备皮，碘伏、酒精消毒左后肢表皮；(3)将小鼠俯卧固定，定位大腿股骨外凹陷处，做一条长约1.5cm的纵行切口；(4)钝性分离肌肉，暴露坐骨神经及其三条分支，即腓总神经、胫神经、腓肠神经；(5)用5-0号缝合线结扎腓总神经、胫神经，在距离结扎点2-4mm近下肢处剪断，注意操作过程中避免牵拉神经，做双层结扎，确保腓肠神经不受损伤；(6)依次缝合肌肉、表皮，在伤口处给予青霉素防止感染，待动物清醒前注意对动物进行保暖；(7)假手术组除不对神经进行结扎跟剪断之外，其它操作相同。2.4真核表达质粒pcDNA3.1/myc-His-VGLUT2构建(1)以SD大鼠全脑组织为材料用Trizol法提取组织总RNA：将组织放入灭RNA酶的2mlEP管中，加0.3mlTrizol和2颗酒精处理过的小钢珠，高通量组织研磨仪研磨组织；研磨完毕后，补0.7mlTrizol，剧烈震荡10s；加0.2ml氯仿，剧烈振荡15s，室温放置3min，4°C，12,000rpm离心15min；吸取上清液（大约500µl）至1.5mlEP管，加入等体积异丙醇，混合均匀，室温放置10min，4°C12,000rpm离心10min，弃去上清；加入1ml70%乙醇，用涡旋仪将沉淀漂起，4°C，7,500rpm离心3min，吸尽上清；在超净台中晾2min，根据沉淀体积加适量DEPC水，冰上静置10min使RNA完全溶解。27 军事科学院博士学位论文(2)以上步提取得到的RNA为模板合成cDNA，反应体系如下：RNA5µgOligod（T）0.5µldNTPmix2µlRNaseinhibitor0.5µlM-ML0.5µl5×Buffer2µlDEPCH2Oupto20µl反应条件为：42℃1h，70℃5min。(3)PCR扩增大鼠VGLUT2开放阅读框序列：以上步所得cDNA为模板，以sence:5’-CGGAATTCATGGAGTCGGTAAAACAAAG-3’；antisence:5’-CCGCTCGAGTATGAATAATCATCTCGGTC-3’为引物PCR扩增VGLUT2开放阅读框序列，具体反应体系如下：cDNA5µl10µMPrimer(F+R)1µl2×EsTaqMasterMix25µlH2Oupto50µl反应条件为：94℃2min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，30cys；72℃2min。(4)PCR产物回收纯化本实验以天根DNA产物回收试剂盒（DP209-03）回收纯化PCR产物。具体实验步骤详见公司产品说明书。(5)DNA片段及pcDNA3.1/myc-His质粒双酶切：本实验采用的两种酶分别是EcoRⅠ和XhoⅠ,具体反应体系如下：PCR产物载体DNA30µl2µgBuffer(10×)5µl2µlEcoRⅠ3µl1µlXhoⅠ3µl1µlddH2OUpto50µlUpto20µl反应条件为37℃水浴1-2h。(6)双酶切产物胶回收：将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下切下所需片段。称重后，按质量体积比加入3倍体积的溶胶液，65℃溶胶10min至胶完全溶解，接下来的方法与PCR产物回收一样，详见PCR产物回收纯化部分。(7)质粒与DNA片段连接，反应体系如下：载体DNA100ng28 军事科学院博士学位论文目的片段DNA100ngT4DNAligase0.5µl10×ligaseBuffer2µlddH2OUpto20µl室温条件下连接1-2h。(8)DNA连接产物的细菌转化：将10µl连接产物与50µ1DH5α感受态充分混匀，冰浴30min，42℃水浴90s，冰浴2min。然后加250µlLB培养基，37℃摇床振+摇lh，离心后接种于含有Amp抗性的LB琼脂平板上，37℃培养过夜。(9)菌落PCR鉴定:在超净台中用20µl枪头挑取单一菌落，在含有10µl的LB培养基中反复吹打数次，让挑取的菌落充分溶解于培养基中，取其中1µl为模板进行菌落PCR鉴定，反应体系如下，DNA1µl10µMPrimer（F+R）2µl2×Taq酶10µl10×Buffer2µlddH2OUpto20µl反应条件与第一步中的PCR扩增条件相同。(10)质粒DNA的小量提取及测序+将上步鉴定结果得到了阳性条带后剩下的菌液置于含有Amp抗性的液体LB培养基中，于37℃条件下，震荡培养过夜，随后进行质粒小提（天根公司，DP118-02）,具体实验步骤详见公司产品说明书。测浓度后分装送至生工生物科技有限公司进行测序鉴定，剩余部分-20℃保存备用。(11)去内毒素质粒小提+挑取上述测序正确的冻存菌液接种到含15mlLB液体培养基（Amp抗性）的锥形瓶中，于37℃条件下，震荡培养过夜。随后进行去内毒素小提（OMEGA公司，D6948-01），具体实验步骤详见公司产品说明书，测浓度后-20℃保存备用。2.5PC12细胞转染2.5.1PC12细胞的复苏从液氮罐中取出含PC12细胞的冻存管，放入37℃水浴箱中，快速使其融化；将细胞转移到含5ml预热培养基的15ml离心管中，1000rpm，离心5min，弃上清；根据离心得到的细胞含量加入适量PC12细胞培养基重悬细胞，接种于相应29 军事科学院博士学位论文大小的细胞培养皿中；显微镜下观察，将细胞放在37℃，含5%的细胞培养箱中；24h后更换新鲜细胞培养液。2.5.2PC12细胞的传代培养待细胞密度大约为80%-90%时，吸去培养皿中的培养液，PBS洗2遍后加入适量0.15%的胰蛋白酶，于培养箱中放置2-3min，取出并在显微镜下观察，待细胞脱壁后立即加入3倍于胰蛋白酶的含10%FBS的DEME细胞培养液终止消化，收集到15ml离心管，1000rpm离心5min收集细胞。重悬后的细胞于37℃，5%CO2培养箱中培养，第2天需要更换培养基。2.5.3PC12细胞的冻存选择对数生长期的细胞，吸取培养液，PBS洗一次，加入适量0.15%的胰蛋白酶，于37℃，5%CO2培养箱中放置2-3min，显微镜下观察，待细胞脱壁后立即加入3倍于胰蛋白酶的含10%FBS的DEME细胞培养液，收集到15ml离心管，1000rpm离心5min收集细胞。加入由5份DMEM培养基、4份胎牛血清和1份DMSO配成的冻存液，轻轻重悬细胞。将重悬的细胞转移到无菌的冻存管，放入预先放置于室温的程序降温盒后放入-70℃。24h后放入液氮罐中。2.5.4根据Lipofectamine2000转染试剂中的实验指导进行质粒转染，具体操作步骤如下：(1)转染前一天将PC12细胞接种于6孔板培养皿中，培养过夜，使其24h后长到60%-70%时进行转染；(2)用250μlopti-MEM稀释2μg质粒DNA，同时用250μlopti-MEM稀释6μl的Lipofectamine2000转染试剂，分别混匀后，室温静置5min；(3)将上述质粒稀释液与Lipofectamine2000稀释液混合，混匀后室温静置30min；(4)将转染混合物逐滴加入培养皿中，轻轻摇晃混匀；(5)置于含5%CO2，37℃恒温培养箱6h后更换新鲜培养基，48h后收集细胞备用。2.5.5采用公司提供的LipofectamineRNAIMax转染试剂的实验指导进行siRNA-VGLUT2的PC12细胞转染，本实验所用siRNA-VGLUT2购自sigma公司，具体转染步骤如下：(1)转染前一天将PC12细胞接种于6孔板培养皿中，培养过夜，使其24h后长到40%-50%时进行转染；(2)将250μlopti-MEM与5µlsiRNA混合稀释，同时将250μlopti-MEM与5μlLipofectamineRNAIMax转染试剂混合，分别混匀后，室温静置5min；(3)将上述质粒稀释液与LipofectamineRNAIMax稀释液混合，混匀后室温静置20min；30 军事科学院博士学位论文(4)将转染混合物逐滴加入培养皿中，轻轻摇晃混匀；(5)置于含5%CO2，37℃恒温培养箱6h后更换新鲜培养基，48h后收集细胞备用。2.6蛋白免疫印迹实验2.6.1细胞全蛋白的提取吸除培养皿中细胞培养液，用4℃预冷的PBS洗1遍。加适量含蛋白酶抑制剂的RIPA细胞裂解液，将细胞全部收集到1.5ml离心管中。将离心管至于冰上30min，每隔5~10min混匀一次，使细胞充分的裂解。4℃，13,000rpm离心10min，将上清转移到一个新的1.5ml离心管中。2.6.2组织全蛋白的提取取约50mg组织至2mlEP管中，加入小钢珠和0.3ml含蛋白酶抑制剂的组织裂解液，用高通量组织研磨仪对组织进行研磨。4℃、3000g离心10min，将上清液转移至新的EP管中。4℃、13000g离心30min，吸取上清液至新的EP管中。2.6.3BCA方法测定蛋白含量和蛋白变性以BSA标准溶液测定蛋白浓度（X）与OD（Y）之间的标准曲线蛋白质浓度BSA或待测样品WR工作试剂(µg/ml)体积(µl)(µl)BSA02520025501002004008001600Sample25200(1)在96孔板中，加入上表所示的标准BSA溶液、蛋白样品；(2)将50体积BCAReagent与1体积CuReagent混合即为WR工作试剂；(3)加入200µlWR工作试剂，立即混匀；(4)37℃反应30min，测定562nm光密度（OD）值；(5)依据所得的标准曲线，以测出的OD为Y值，计算蛋白的浓度X；(6)根据所得的蛋白浓度计算煮多少蛋白样品：一般上样量为10-50µg，加入5×SDS上样缓冲液，混匀，100℃，加热5min使蛋白变性，然后在冰上放31 军事科学院博士学位论文置5min，-70℃保存或直接点样。2.6.4SDS-PAGE胶配制(1)取2块制胶玻璃板，洗净，用ddH2O清洗后晾干，组装制胶装置；(2)12%下层分离胶的配制（配方如下，以2块胶为例）：30%Arc/Brc4ml1.5MTris(pH8.8)2.5mlddH2O3.5ml10%SDS100µl10%AP50µlTEMED10µl(3)充分混匀分离胶混合液，加入灌胶板内，到胶面距离玻璃板上端大约2.5cm时为止，立即加1ml异丙醇压平胶面；(4)30min后待分离胶凝好后，倒掉异丙醇，用水冲一下，滤纸吸干剩余水分；(5)上层浓缩胶的配制（配方如下，以2块胶为例），加入浓缩胶至玻璃板顶端，小心的插入梳子，避免产生气泡；30%Arc/Brc0.83ml1MTris(pH6.8)0.63mlddH2O3.4ml10%SDS50µl10%AP50µlTEMED10µl2.6.5上样，电泳，转膜，显色(1)将SDS-PAGE的跑胶装置装配好，拔出梳子，加入1×SDS-PAGE电泳缓冲液。将制备好的蛋白样品和蛋白Marker点入相应胶孔中。先在80V电压下，电泳20min，使蛋白在浓缩胶中浓缩。待蛋白跑到分离胶后将电压调到120V，电泳约1h直至溴酚蓝指示剂跑到凝胶底部，停止电泳；(2)转膜：将预先准备好的0.45mmPVDF膜置于甲醇中浸泡至少10s，取出之后放入转膜缓冲液中浸泡。将滤纸、PVDF膜、凝胶按以下顺序放置在湿转缓冲液中：（−）黑板—滤纸—凝胶—PVDF膜—滤纸—白板（+），每加一层都要尽量赶尽气泡。200mA恒流转膜2h；(3)转膜结束后，取出PVDF膜用PBST冲洗一下，加入5%的脱脂牛奶室温封闭1h；(4)用5%的脱脂牛奶稀释一抗，与PVDF膜室温1h或者4℃过夜孵育；32 军事科学院博士学位论文(5)取出PVDF膜，PBST洗三次，每次10min；(6)用5%的脱脂牛奶按一定的比例稀释二抗，室温孵育1h；(7)取出PVDF膜，PBST洗三次，，每次10min；(8)等体积混合发光液1和2，均匀滴加至PVDF膜上；(9)保鲜膜封闭PVDF膜，固定在感光板上，曝光，显影；(10)利用ImageJ软件读取条带灰度值进行统计分析。2.7免疫组化实验2.7.1心脏灌流小鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，迅速打开胸腔，暴露心脏。经过处理的输液针头从左心室心尖进针，插入主动脉方向，观察到回血后剪破右心房，打开微量注射泵，向内灌流含有20IU/mL肝素的生理盐水，快速冲洗动物全身血液，至右心房流出液体几乎无色，约5~6min内灌流完毕。随后使用50ml冷4%多聚甲醛溶液灌流，灌流后立即取出脊髓腰膨大部位，继续浸泡于4%多聚甲醛中固定24h，随后取出并依次浸入10%、20%、30%蔗糖，直到组织沉底。2.7.2石蜡切片免疫组化实验(1)将脱水完全的组织块进行石蜡包埋，放入切片机，做4-5μm冠状切片，展片后贴在多聚赖氨酸包被过的载玻片上，烤干；(2)依次将切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-二甲苯III15min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-85%酒精5min-75%酒精5min-蒸馏水洗；(3)组织切片置于盛满柠檬酸抗原修复缓冲液（pH6.0）的修复盒中于微波炉内进行抗原修复，中火8min至沸，停火8min保温再转中低火7min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS（pH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min；(4)切片放入3%双氧水溶液，室温避光孵育25min，将玻片置于PBS（pH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min；(5)在组化圈内滴加3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。（一抗是山羊来源的用兔血清封闭，其他来源的用BSA封闭）；(6)轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）；(7)将玻片用PBS于脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗（HRP标记）覆盖组织，室温孵育50min；(8)玻片置于PBS（pH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍33 军事科学院博士学位论文甩干后在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，自来水冲洗切片终止显色；(9)苏木素复染3min左右，自来水冲洗，苏木素分化液分化数秒，自来水冲洗，苏木素返蓝液返蓝，流水冲洗；(10)将切片依次放入75%酒精5min-85%酒精5min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-二甲苯Ⅰ5min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片；(11)显微镜镜检，应用Image-ProPlus6.0软件读取累积光密度值进行统计分析。2.8组织免疫荧光双重标记实验2.8.1冰冻切片将冰冻切片机的温度设置为-20℃，用OCT包埋剂包埋组织，放入切片机内冷冻至组织冻实。设定片厚为20µm，做连续恒冷冠状切片，切片后展片，贴片至多聚赖氨酸包被过的载玻片上，室温晾干，随后保存于-20℃。2.8.2冰冻切片免疫荧光染色步骤(1)冰冻切片固定：冰冻切片从冰箱拿出来复温，晾干水分；(2)抗原修复：将组织切片浸置柠檬酸抗原修复缓冲液（pH6.0）中，微波炉内中火5min，停火5min，转低火10min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片浸置PBS中，在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min；(3)封闭：滴加5%BSA，封闭30min；(4)加一抗：滴加PBS配置的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）；(5)加二抗：将玻片浸置PBS中，在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，滴加PBS配置的与一抗相对应的二抗（含DAPI），室温避光孵育50min；(6)封片：将玻片浸置PBS中，在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片；(7)镜检拍照：切片于荧光显微镜下观察并采集图像。（DAPI紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm，发蓝光；FITC激发波长465-495nm，发射波长515-555nm，发绿光；CY3激发波长510-560，发射波长590nm，发红光）。34 军事科学院博士学位论文2.9定量和统计分析GraphPadPrismVersion5(GraphPadSoftware,Inc.,LaJolla,CA,USA)软件用于统计分析。数据均以mean±SEM表示，机械痛阈值检测实验中，采用双因素方差分析Two-wayANOVA；蛋白免疫印记检测VGLUT2表达变化实验中，采用单因素方差分析One-wayANOVA；免疫组化检测VGLUT2表达变化实验中，两组比较采用Student’st检验，p<0.05为具有统计学意义。3实验结果3.1VGLUT2抗体验证由于本研究大量运用蛋白免疫印迹方法检测VGLUT2蛋白表达情况，因此我们首先对用于VGLUT2蛋白免疫印迹实验的抗体进行了验证。将构建成功的真核表达质粒pcDNA3.1/myc-His-VGLUT2及siRNA-VGLUT2通过脂质体转染到PC12细胞中，48h后收集细胞全蛋白进行蛋白免疫印记实验。并通过DAB染色方法对用于免疫组化的VGLUT2抗体进行了验证。3.1.1大鼠VGLUT2真核过表达质粒构建由于PC12是大鼠源细胞系，因此我们以大鼠cDNA为模板构建VGLUT2真核表达质粒pcDNA3.1/myc-His-VGLUT2。如图所示PCR扩增产物所得琼脂糖凝胶电泳结果条带单一、位置与VGLUT2大小一致，说明此PCR反应的特异性较高。图5大鼠VGLUT2PCR扩增产物鉴定1：DNAmarker，D2000；2：大鼠VGLUT2PCR扩增产物图6中菌落PCR鉴定结果同样得到了明亮的单一条带，且位置与VGLUT2基因大小相一致，初步说明我们所构建的质粒正确，测序结果进一步确证了我们35 军事科学院博士学位论文所构建的质粒。图6VGLUT2真核表达质粒菌落PCR鉴定6：DNAmarker，D2000；2-5：从实验组中随机挑选的菌落PCR产物；1：从对照组中随机挑选的菌落PCR产物3.1.2在PC12细胞中过表达、敲减VGLUT2进行蛋白免疫印迹抗体验证将pcDNA3.1/myc-His-VGLUT2质粒转染到PC12细胞中，48h后提取细胞总蛋白，用CST公司货号为71555的VGLUT2抗体检测蛋白表达水平及条带的位置。图7结果显示，与转染了空载质粒的对照相比过表达VGLUT2能够显著升高细胞内72KD位置的蛋白表达水平，与VGLUT2蛋白分子量大小基本一致，因此说明我们所选用的抗体能够正确检测到VGLUT2蛋白。图7pcDNA3.1/myc-His-VGLUT2转染PC12细胞48h蛋白表达情况为进一步对抗体进行验证，我们将特异性靶向VGLUT2的siRNA转染到了PC12细胞中，结果显示，siRNA-VGLUT2能够下调VGLUT2所在的68KD位置的蛋白表达水平。以上结果说明，CST公司货号为71555的VGLUT2抗体确实能够用于WB水平VGLUT2蛋白表达的检测。36 军事科学院博士学位论文图8siRNA-VGLUT2转染PC12细胞48h蛋白表达情况3.1.3在脊髓石蜡切片中进行DAB染色验证VGLUT2免疫组化抗体利用小鼠脊髓石蜡切片，我们对本研究中所用的VGLUT2免疫组化抗体（Abcam，ab79157）进行了验证，结果显示在加入了VGLUT2抗体的脊髓切片中，细胞呈阳性着色状态，而在未加入VGLUT2的脊髓切片中，并没有细胞呈阳性着色状态。图9VGLUT2抗体在小鼠脊髓组织DAB染色情况所用抗体为Abcam公司的VGLUT2抗体（ab79157），阴性对照除将一抗换成一抗稀释液之外其它步骤与实验组完全一样，图片放大倍数为200×3.2SNI神经病理性痛模型的构建及验证为确认VGLUT2与神经病理性痛的相关性，我们建立了经典的SNI神经病理性痛模型。30只小鼠在SNI手术后分成5组：术后SNI-1d，SNI-4d，SNI-7d，SNI-14d，SNI-21d。分别在术前和术后不同时间（1，4，7，14，21d）用Vonfrey纤维丝检测机械痛阈值变化。各组SNI小鼠在同一时间的机械痛阈值没有显著型差异，因此下图仅示SNI-21d组动物机械痛阈值结果。RepeatedmeasureTwo-wayANOVA检验提示，SNI手术使动物的机械痛阈值发生了显著变化（F[1,50]=274.08,p<0.0001），与假手术组动物相比较，SNI术后第1天动物机械痛阈值便发生了显著性的下降（1.09±0.16gvs.0.32±0.07g,p<0.0001），产生的机械痛敏至少持续21天（1.15±0.12gvs.0.12±0.06g,p<0.0001），说明SNI模型构建成功。37 军事科学院博士学位论文图10SNI术后小鼠机械痛阈检测术前和术后1、4、7、14、21天小鼠机械痛阈值，mean±SEM，Two-wayANOVA，Bonferronipost-hoctest，***p<0.001与同一天假手术组动物比较，n=63.3SNI术后不同时间点脊髓VGLUT2表达变化3.3.1蛋白免疫印记检测SNI术后脊髓VGLUT2表达变化我们分别于SNI术后第1、4、7、14、21天对小鼠脊髓进行取材，然后采用Westernblot方法检测VGLUT2蛋白的表达情况。结果显示，假手术组动物VGLUT2蛋白水平并无显著变化，而SNI手术组VGLUT2蛋白水平显著性升高（F[6,36]=6.249,p<0.0001），posthoc检验提示，与Naive动物相比较术后第7、14、21天VGLUT2蛋白表达变化具有显著性，分别升高了31%±9%（p<0.05）、33%±11%（p<0.05）、27%±7%（p<0.05）。以上结果提示，VGLUT2蛋白表达升高可能与神经病理性痛相关。2.01.5***1.00.5VGLUT2(foldchange)0.0NaiveSham1471421DaysafterSNI图11SNI手术对小鼠脊髓VGLUT2蛋白表达的影响mean±SEM，One-wayANOVA，Newman-Keulstest，*p<0.05与Naive组动物比较，n=738 军事科学院博士学位论文3.3.2选取腰膨大脊髓背角区示意图参照小鼠脊髓立体定位图谱，选择腰膨大脊髓段进行冠状面切片及背角部位进行拍照分析，下图所示即为观察拍照区示意图。图12小鼠腰膨大部位脊髓背角图谱3.3.3免疫组化检测SNI术后脊髓VGLUT2表达变化采用免疫组化实验方法对SNI术后第14天脊髓VGLUT2表达情况进行了检测，如图13，Studentt-test检测结果显示，与假手术组相比，SNI术后VGLUT2蛋白表达显著上升（p<0.05），这与上述WB结果是相一致的。15000*100005000IODvalue/section0ShamSNI图13SNI手术14天对小鼠脊髓背角VGLUT2蛋白DAB染色的影响mean±SEM，Studentt-test，*p<0.05与Sham组动物比较，n=4-5，图片放大倍数为200×3.3.4免疫荧光双标检测SNI术后VGLUT2细胞类型定位39 军事科学院博士学位论文为进一步研究神经病理性痛小鼠中VGLUT2蛋白的细胞类型分布情况，我们利用免疫荧光双重标记方法对SNI脊髓背角中VGLUT2与四种细胞的蛋白标志物进行了标记，结果显示，SNI术后VGLUT2荧光强度上升，此结果与westernblot结果一致；免疫荧光双重标记结果显示SNI术后脊髓背角中VGLUT2主要与神经元胞体（NeuN）以及轴突（MAP2）发生了共定位，而与小胶质细胞（IBA1）及星形胶质细胞（GFAP）基本不发生共定位，说明SNI术后脊髓背角中的VGLUT2主要表达于神经元细胞中，而不表达于胶质细胞中。图14SNI手术14天对小鼠脊髓背角VGLUT2细胞分布的影响VGLUT2（红色），神经元胞体标志蛋白NeuN（绿色）,树突标志蛋白MAP2（绿色），星型胶质细胞标志蛋白GFAP（绿色），小胶质细胞标志蛋白IBA1（绿色），图片放大倍数为200×40 军事科学院博士学位论文4小结在本部分研究中，我们发现SNI诱发的神经病理性痛使小鼠脊髓VGLUT2蛋白表达显著上升，进一步研究发现升高的VGLUT2主要来源于脊髓背角神经元而非星型胶质细胞或小胶质细胞。41 军事科学院博士学位论文第二部分VGLUT2shRNA慢病毒对神经痛及谷氨酸释放的影响通过第一部分研究结果我们发现，神经病理性痛小鼠脊髓VGLUT2表达显著升高；本实验室前期研究发现，神经病理性痛小鼠丘脑VGLUT2表达显著升高，VGLUTs非选择性抑制剂CSB6B能够有效减轻神经病理性痛症状，并且能够降低丘脑突触体谷氨酸的释放水平，但由于CSB6B并不具有亚型选择性。为了进一步研究脊髓及丘脑中VGLUT2在神经痛中的作用，本研究中，我们利用RNA干扰技术实现了对成年小鼠脊髓和丘脑VGLUT2的选择性干预。我们设计合成三条特异性shRNA干扰序列，构建和制备VGLUT2shRNA慢病毒，利用原代培养神经元进行了体外筛选并测定了培养基中谷氨酸的释放情况，通过鞘内注射或定向微量注射将VGLUT2shRNA慢病毒于SNI术前或术后注入小鼠脊髓或丘脑VPL区，进一步探究VGLUT2与神经病理性痛的相关性。1实验材料1.1实验动物C57BL/6小鼠，雄性，7-8周龄，购自斯贝福（北京）实验动物科技有限公司，SPF级动物，动物合格证号：SCXK（京）2016-0002，每只笼子放置5-6只，饲养环境恒温恒湿，日光灯每12h明暗交替，自由摄食饮水。C57BL/6乳鼠，24h新生，购自斯贝福（北京）实验动物科技有限公司，SPF级动物，动物合格证号：SCXK（京）2016-0002。1.2293T细胞株293T细胞是293细胞即人肾上皮细胞系的衍生株，来源于人胚胎肾细胞。细胞培养液的配方为：10%胎牛血清的DMEM培养液，在37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。1.3细菌菌株和质粒1.3.1细菌菌株大肠杆菌DH5α感受态细胞购自天根生物公司。1.3.2慢病毒包装三质粒系统(1)慢病毒载体pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen42 军事科学院博士学位论文图15pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen质粒图谱(2)pSPAX2、pMD2G辅助质粒图16pSPAX2、pMD2G质粒图谱1.4实验试剂（与第一部分相同的试剂不再重复）1.原代神经元分离及培养试剂Neurobasal培养基GIBCOB27GIBCO0.15%胰蛋白酶MPBiomedicals阿糖胞苷SigmaSigma多聚赖氨酸Hyclone氢链霉素GIBCODulbecco’smodifiedEaglemedium(DMEM)Hyclonehorseserum(HS)ExCellBiofetalbovineserum(FBS)43 军事科学院博士学位论文2.293T细胞培养试剂Dulbecco’smodifiedEaglemedium(DMEM)GIBCO胎牛血清(FBS)ExCellBio3.RNA提取试剂TrizolreagentSigma三氯甲烷国药集团异丙醇国药集团70%乙醇国药集团DEPC水Amresco4.Real-timeRCP所需试剂RevertAidTMFirstStrandcDNASynthesiskitInvitrogenSYBRGreenThermo5.细胞免疫荧光ICC试剂4%多聚甲醛固定液普利莱TritonX100SeaskyBioBSAAmresco6.病毒立体定位注射所需试剂戊巴比妥钠Sigma石家庄四药生理盐水捷利康75%消毒酒精10%双氧水国药集团碘伏捷利康亿申康84消毒酒精北京双吉制药红霉素眼膏7.主要抗体VGLUT2(WB)CST,71555（1:1000）VGLUT2(免疫荧光)Abcam,ab72310（1:100）NF-MAbcam,ab9034（1:500）44 军事科学院博士学位论文GFPServicebio,GB13227（1:200）8.突触体提取试剂蔗糖国药集团HEPESAmrescoPercollSigmaEDTA北京化学试剂公司DTTInvitrogenNaCl国药集团KCl国药集团NaHCO3国药集团MgCl2·6H2O国药集团Na2HPO4·12H2O国药集团葡萄糖9.谷氨酸释放检测试剂国药集团谷氨酸Sigma+NADPSigma谷氨酸脱氢酶国药集团CaCl2Sigma4-APSigmaL-trans-2-4-PDC1.5实验仪器（与第一部分相同的仪器不再重复）仪器公司或品牌荧光显微镜Olympus公司Envision2104荧光酶标仪美国PerlinElmer小鼠脑立体定位仪STOELTING微量进样针WPI颅钻SΛESHIN微量注射泵KDScientificReal-time实时荧光PCR仪AppliedBiosystems发光成像分析仪FUJIFILM公司45 军事科学院博士学位论文2实验方法2.1试剂配方溶液名称配制方法293T细胞培养基配置DMEM10%FBS5,000units/mlpenicillin/streptomycin原代神经元培养基配置49mlNeurobasal1mlB27(50ml)解剖液（1×）0.2gKCl8gNaCl2.9gNa2HPO4·12H2O0.2gKH2PO43g葡糖糖7.5g蔗糖10万单位青链霉素至1LddH2O接种液80%DMEM10%马血清10%胎牛血清10万单位青链霉素320mM蔗糖匀浆液5.4766g蔗糖（320mM）（pH7.4）0.0476gHEPES（4mM）50mlH2OPercoll稀释液（pH7.4）6.572g蔗糖（320mM）0.0175gEDTA（1mM）0.0023gDTT（0.25mM）60mlH2OHEPES缓冲液（pH7.4）0.8182gNaCl（140mM）0.0373gKCl（5mM）0.042gNaHCO3（5mM）0.0203gMgCl2·6H2O（1mM）0.043gNa2HPO4·12H2O（1.2mM）0.1982g葡萄糖（10mM）46 军事科学院博士学位论文0.2383gHEPES（10mM）100mlH2O2.2含GFP荧光标记的VGLUT2shRNA慢病毒载体构建本部分实验委托汉恒生物科技有限公司完成(1)根据VGLUT2基因Slc17a6的转录本通过http://rnaidesigner.thermofisher.com.网站设计siRNA干扰靶点，并进行引物合成；(2)引物退火形成带粘性末端的双链片段，反应体系如下：Tris-cl(pH7.5)10mMNaCl50mMEDTA1mMshDNA-R/shDNA-F（1001/1μlH2OUpto20μlμM）95℃温浴10min。(3)用限制性内切酶对表达载体进行酶切，反应体系如下：10×Buffer2μlBamHI1μlEcoRI1μl载体（500ng/μl）2μlH2O14μl37℃水浴1-2h。(4)胶回收酶切载体；(5)将干扰片段与胶回收得到的酶切载体进行链接，反应体系如下：稀释好的退火产物1μl酶切好的载体100-200ng10×T4ligaseBuffer2μlT4ligase1μlH2OUpto20μl16℃，链接过夜l(6)转化，具体步骤见第一部分，Amp抗性；(7)在转化得到的平板中挑菌，37℃摇菌过夜（14h左右），将菌液送测序公司测序，引物为U6；(8)将测序正确的菌液进行摇菌后进行质粒小提。47 军事科学院博士学位论文2.3表达VGLUT2shRNA的慢病毒载体包装本部分实验委托汉恒生物科技有限公司完成(1)将构建好的慢病毒载体和辅助质粒分别进行大量抽提；(2)铺板293T细胞与10mm的细胞培养皿中用于转染，使24h后的生长密度达到70-80%；(3)进行脂质体转染，各质粒所需量如下:pSPAX210μgpMD2G5μgpHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen10μgTMLipofiter75μL(4)转染6-8h后进行换液，换成含10%FBS的DMEM完全培养基；(5)收毒：分别于转染48h和72h后收集病毒上清(48h收集后置换新鲜完全培养基)；(6)超速离心：将50mL离心管中的病毒上清，4℃，2000g，10min，去除细胞碎片；然后收集病毒原液上清置于超速离心管中，4℃，82700g，离心120min，最后将慢病毒超离液分装到灭菌处理的病毒管中；(7)病毒保存：按照要求分装病毒，标记（病毒名称，年-月-日），-70℃冰箱保存；(8)用稀释计数法对病毒进行滴度检测。2.4原代神经元培养(1)多聚赖氨酸包被培养板；(2)新生24hC57小鼠，75%酒精浸泡消毒，断头。无菌条件下，沿纵轴撕开皮肤和颅骨，打开颅腔，取出脑组织并移入盛有预冷解剖液的培养皿中，体式显微镜下用细镊撕去脑表面的脑膜和血管，取前额皮层剪碎；(3)加入比组织块体积多30-50倍的0.25%胰蛋白酶，吹打均匀，37℃消化15-20min，每隔5min震荡1次。移至离心管，加入等体积接种液，混匀终止消化，200目筛过滤，1500r/min离心5min，弃上清；(4)加入适量接种液吹散，接种于培养板内；(5)第二天，饲养液预热至37℃，将接种液更换为饲养液；(6)第五天，加入3-5µg/ml阿糖胞苷，半量换液；(7)第六天，换饲养液，半量换液；(8)第八天，准备实验。48 军事科学院博士学位论文2.5细胞免疫荧光实验(1)吸去培养基，加入4%多聚甲醛固定30min；(2)吸走多聚甲醛，1×PBST洗三次，10min/次；(3)加入0.5%TritonX100（PBS配制）通透5min；(4)加入封闭液（含5%BSA的PBST），室温封闭30min；(5)加入封闭液配制的一抗（NF-M抗体1：500稀释），4℃孵育过夜；(6)吸走一抗，用1×PBST洗三次，10min/次；(7)加入封闭液配制的二抗（1:3000稀释），室温孵育1h,之后开始注意避光；(8)吸走二抗，用1×PBST洗三次，10min/次；(9)荧光显微镜下拍照。2.6原代培养神经元的病毒感染(1)从-70℃冰箱取出病毒在冰上慢慢融化；(2)吸去细胞原有培养基，加入1/2体积培养基（此培养基为混匀有病毒原液的新鲜培养基），37℃感染4h后补齐培养液至正常体积；(3)感染后第二天，吸去含病毒的培养液，继续37℃培养；(4)感染10天后收细胞用于Western或real-timePCR检测。2.7Real-timePCR和蛋白免疫印迹检测原代培养神经元VGLUT2表达2.7.1蛋白免疫印记参照第一部分实验方法。2.7.2细胞总RNA的提取本实验室采用Trizol法提取RNA。具体步骤如下：(1)取组织约50mg，放入灭RNA酶的2mlEP管中，加入0.3mlTrizol和2颗酒精处理的小钢珠，高通量组织研磨仪研磨组织。研磨完毕后，补加0.7mlTrizol，剧烈震荡；(2)加0.2ml氯仿，剧烈振荡15s，室温放置3min，4°C，12,000rpm离心15min；(3)将上清液（大约500µl）转移至新的1.5mlEP管中，加入等体积异丙醇，混合均匀，室温放置10min，4°C12,000rpm离心10min，弃上清；(4)加入1ml70%乙醇，用涡旋仪使沉淀漂起，4°C，7,500rpm离心3min，吸尽上清。在超净台中晾2min，加42.5µlDEPC水，静置10min使RNA完49 军事科学院博士学位论文全溶解；(5)按以下体系混合消化反应体系，37°C孵育30min。RNA10µgDNaseⅠ（RNase-free,2U/ul）2µlRNaseinhibitor（optional,40U/ul）0.5µlDNaseⅠ10×Buffer5µlRNase-freeddH2Oupto50µl(6)补50µlDEPC水，然后向反应体系中加入酚和氯仿1：1混匀的抽提液100µl，剧烈涡旋15s，室温放置3min，4°C12,000rpm离心15min；(7)取100µl上清到新的1.5mlEP管，加等体积异丙醇。室温放置10min，4°C12,000rpm离心10min，弃上清；(8)用1ml70%乙醇洗涤RNA沉淀，室温晾干后加适量DEPC水使RNA充分溶解，然后测定RNA的浓度。2.7.3cDNA的合成按下列反应体系混合反应体系。RNA500ngOligod（T）0.5µldNTPmix2µlRNaseinhibitor0.5µlM-ML0.5µl5×Buffer2µlRNase-freeddH2Oupto10µl反应条件为：42℃1h，70℃5min。反应结束后，稀释20倍，备用。2.7.4Real-timeRT-PCR检测反应体系为：cDNA2µl；引物（F+R）10µM1µl；SYBRGreenI(2×)5µl；DEPC水upto10µl；反应条件为：预变性：95℃10min；循环：95℃15s、60℃30s、72℃30s，扩增40个循环；延伸：72℃10min。50 军事科学院博士学位论文本实验所用到的Real-Time引物名称引物序列β-actinSense：ACCAACTGGGACGACATGGAGAAAnti-sense：TACGACCAGAGGCATACAGGGACVGLUT2Sense：ACGGTGCTACCTCACAGGAGAnti-sense：TCTTGCGCACCTTCTTGCAC2.8机械痛阈测定具体实验方法参见第一部分2.9SNI模型构建具体实验方法参见第一部分2.10鞘内注射VGLUT2shRNA慢病毒左手戴纱布手套，掌心压住鼠身，拇指跟中指按压骶骨两侧进行固定，食指按在双骶骨前缘连线正中点皮肤上（可触知棘突）指示进针点，右手持50µl尖头注射器与脊柱上方成20度角于棘突间隙进针，针头斜面向下，以鼠尾出现突然侧向运动为成功标志，注射体积为5µl时间约5-10s，推出后停针1-2min，之后缓慢拔出。2.11丘脑VPL脑区微量注射VGLUT2shRNA慢病毒(1)小鼠称重后，用40mg/kg戊巴比妥钠对小鼠进行腹腔注射麻醉；(2)用镊子轻夹动物脚掌或尾尖确认麻醉成功之后，备皮，碘伏、酒精消毒头顶表皮；(3)将小鼠俯卧，头部用耳杆固定在脑立体定位仪上；(4)用小剪子延中线剪开头顶皮肤2-3cm，接着用10%H2O2将脑膜烧毁，找到前囟；(5)定位坐标为：AP,-1.6mm;ML,+1.8mm;DV,-3.7mm.用颅钻在头盖骨上按此坐标钻一个小孔；(6)用微量进样针进行病毒注射，注射体积为0.5µl，进样速度为200nl/min，注射完后留针2min；51 军事科学院博士学位论文(7)缝合表皮，在伤口处给予青霉素，在眼部涂抹红霉素药膏防止感染，待动物清醒前注意对动物进行保暖。2.12原代培养神经元谷氨酸释放实验在本研究中，我们用BioVision公司的谷氨酸测定试剂盒对原代神经元谷氨酸释放进行了检测，具体操作步骤如下：(1)收集细胞培养基，1000rpm，离心5min去除细胞碎片等杂质；(2)将第一步中收集得到细胞培养液或者标准谷氨酸溶液用AssayBuffer补齐到50µl；(3)然后加100µlReactionMix（90µlAssayBuffer+8µlglutamatedeveloper+2µlglutamateenzyme），37℃避光孵育30min；(4)在酶标仪中将波长设置为450nm进行OD检测。2.13脊髓、丘脑突触体谷氨酸释放实验2.13.1突触体提取(1)将小鼠戊巴比妥钠深度麻醉后断头处死，快速取全脑或脊髓置于冰上，分离丘脑VPL脑区或脊髓腰膨大；(2)加入320mM（pH7.4）的蔗糖溶液后进行组织匀浆；[71](3)参照Percoll不连续梯度提取的方法，匀浆液3000g4℃离心2min，取上层清液14,500g离心12min；(4)沉淀重悬于蔗糖溶液，每1mL突触体悬液置于1.5mLPercoll不连续梯度溶液（3%，10%，23%），32,500g4℃离心7min；(5)收集10%至23%Percoll层之间的突触体沉积物稀释在3mLHBM中，之后27,000g4℃离心10min；(6)将沉淀重悬于HBM中，使用BCA法测定蛋白浓度，在洗涤一次突触体后将其置于冰上，4~6小时内使用。2.13.2谷氨酸释放测定突触体释放的谷氨酸在谷氨酸脱氢酶的作用下可以发生氧化脱氨反应，因此[72]可通过检测所形成的NADPH的荧光强度，来检测溶液中谷氨酸的含量。(1)将突触体悬液（含0.2mg蛋白）或标准谷氨酸溶液，加入96孔板中（100μL/孔），37℃孵育3min；+(2)再加入含有谷氨酸脱氢酶及NADP的缓冲溶液（150μL/孔），37℃孵育5min；52 军事科学院博士学位论文放入荧光酶标仪中采用动力学测定的方法读数（激发波长340nm，发射波长460nm），测试100s作为基础值；(3)加入释放刺激剂4-AP，动力学测定谷氨酸释放5min内反应产生NADPH的荧光强度变化。2.14定量和统计分析GraphPadPrismVersion5(GraphPadSoftware,Inc.,LaJolla,CA,USA)软件用于统计分析。数据均以mean±SEM表示，在原代神经元mRNA及蛋白检测、脊髓及VPL中VGLUT2蛋白检测、原代分离神经元谷氨酸释放、脊髓突触体谷氨酸释放实验中，采用单因素方差分析One-wayANOVA；VGLUT2敲减病毒对SNI动物机械痛阈检测实验中，不同处理组之间采用双因素方差分析Two-wayANOVA；VPL突触体谷氨酸释放、VGLUT2敲减病毒对动物基础机械痛阈检测实验中，不同处理组两两比较用Student’st检验，p<0.05为具有统计学意义。3实验结果3.1VGLUT2shRNA重组慢病毒载体制备与筛选根据VGLUT2基因（Slc17a6）的转录本设计干扰靶点，安排引物合成。将单链的引物退火成双链oligo序列，连接入双酶切线性化的慢病毒载体。转化子送往测序公司进行测序验证。本部分研究共设计并合成了三条特异性针对VGLUT2的shRNA序列（表1）。表1VGLUT2shRNA干扰序列shRNAsymbolshRNAtargetsequencesagainstVGLUT2shRNA-Sc5’-TTCTCCGAACGTGTCACGTAA-3’shRNA-15’-GCTCACCTCTACCCTCAATAT-3’shRNA-25’-GCGATAATTGTTGCCAACTTCTGCA-3’shRNA-35’-CGCAAATCTGCTAGGTGCAATGGAA-3’3.1.1高效感染脊髓的病毒类型筛选53 军事科学院博士学位论文为找到能够高效感染小鼠脊髓的病毒载体进行shRNA-VGLUT2的包装，我们分别将含有GFP的慢病毒（LV）、腺相关病毒（AAV5、AAV9）进行了鞘内注射，结果如图所示，LV及AAV9都能够高效感染小鼠脊髓，而AAV5感染效果低于前两者，由于在原代细胞中LV转染效率高于AAV，考虑到后续细胞实验，我们选择慢病毒进行了shRNA-VGLUT2的病毒包装。图17鞘内注射慢病毒、腺相关病毒AAV5、AAV9对脊髓GFP表达的影响3.1.2原代培养神经元的鉴定为得到有效的VGLUT2干扰序列，我们首先利用原代培养神经元进行序列筛选。光镜下能够清晰的观察到神经元胞体及丰富的突触结构，并且，通过细胞免疫荧光实验利用神经元标志物NF-M（神经丝蛋白）抗体得到的染色结果显示，我们分离得到的神经元高表达NF-M。表明分离得到的细胞高表达神经元标志物，符合筛选实验要求。图18原代神经元NF-M（神经元标志物）免疫荧光染色结果54 军事科学院博士学位论文3.1.3shRNA-VGLUT2序列的筛选我们将三条VGLUT2敲减序列（shRNA-1,shRNA-2,shRNA-3）以及对照序列（shRNA-Sc）转染到原代培养神经元中，如图19A所示，GFP表达相似，表明不同序列的转染效率基本一致，在转染后第10天收集细胞，分别提取细胞总RNA以及蛋白质，结果显示，三条序列都能够显著下调VGLUT2的mRNA表达水平，但仅有shRNA-1和shRNA-2能够显著下调VGLUT2的蛋白表达水平，其中shRNA-1能够将VGLUT2的mRNA和蛋白分别下调至16%±1.5%和43%±10.3%；shRNA-2能够将VGLUT2的mRNA和蛋白分别下调至13%±1.5%和20%±5.1%。图19shRNA-VGLUT2对原代神经元中VGLUT2表达的影响A图示含shRNA-VGLUT2及阴性对照序列慢病毒感染原代神经元10天后细胞表达GFP的情况；B图示实时定量PCR检测结果，β-actin为内参；C图示蛋白免疫印记检测结果，GAPDH为内参；mean±SEM，Studentt-test，**p<0.01，***p<0.001与阴性对照序列shRNA-Scramble（shRNA-Sc）比较，n=355 军事科学院博士学位论文3.2鞘内注射VGLUT2shRNA慢病毒对SNI小鼠机械痛阈的影响3.2.1鞘内注射shRNA-VGLUT2敲减效果验证为验证shRNA-VGLUT2慢病毒的在体敲减效果，我们将VGLUT2shRNA慢病毒注射至正常小鼠脊髓腔内。鞘内注射10天之后收集动物腰膨大组织，进行westernblot检测，结果显示（图20），与shRNA-Sc组动物相比较shRNA-1、shRNA-2都能够显著下调此部位VGLUT2蛋白表达（F[2,15]=4.6,p<0.05），shRNA-1、shRNA-2分别下降至79%±3%和77%±7.3%。表明在整体动物水平实现脊髓VGLUT2表达下调。图20鞘内注射VGLUT2shRNA慢病毒对脊髓VGLUT2蛋白表达的影响GAPDH为内参，mean±SEM，One-wayANOVA，Newman-Keulstest，*p<0.05与阴性对照序列shRNA-Scramble（shRNA-Sc）比较，shRNA-Sc(n=5)，shRNA-1(n=6)，shRNA-2(n=7)3.2.2鞘内注射VGLUT2shRNA慢病毒对小鼠基础机械痛阈的影响为研究下调脊髓VGLUT2对动物基础痛阈的影响，我们将VGLUT2敲减慢病毒鞘内注射到小鼠的腰膨大位置，结果显示，无论是溶剂、无义序列还是shRNA-1、shRNA-2鞘内注射10天后，小鼠的基础机械痛阈值均无变化（p>0.05）。说明干扰脊髓中VGLUT2的表达并不影响小鼠的基础机械痛阈值。56 军事科学院博士学位论文0D1.510D1.00.5Withdrawalthreshold(g)0.0SalineshRNA-ScshRNA-1shRNA-2图21鞘内注射VGLUT2shRNA慢病毒对小鼠基础机械痛阈的影响means±SEM，Student’st-test，saline(n=7)，shRNA-Sc(n=5)，shRNA-1(n=7)，shRNA-2(n=7)3.2.3鞘内注射VGLUT2shRNA慢病毒对SNI小鼠机械痛阈的影响为进一步研究脊髓VGLUT2在神经病理性痛发生发展过程中的作用，我们分别于SNI术前或者术后鞘内注射VGLUT2shRNA慢病毒，观察术后第4、7、10、14天模型动物机械痛阈的变化。结果显示（图22），SNI术前第7天鞘内注射shRNA-VGLUT2显著影响SNI诱导的机械痛敏（F[5,168]=261.78,p<0.0001）。与shRNA-Sc组动物相比，shRNA-1使动物SNI术后第4天机械痛阈值由0.048±0.009g升高到0.43±0.04g（p<0.05），并且这种镇痛效应至少持续到术后第14天，第14天动物机械痛阈值由0.044±0.007g升高到0.39±0.031g（p<0.05）。对于与shRNA-1敲减效果相似的shRNA-2，与shRNA-Sc组动物相比，shRNA-2使动物SNI术后第4天机械痛阈值由0.048±0.009g升高到0.35±0.039g（p<0.05），术后第14天动物机械痛阈值由0.044±0.007g升高到0.43±0.058g（p<0.05）。在另一组实验中，SNI术后第4天鞘内注射VGLUT2敲减病毒显著影响SNI诱导的机械痛敏（图22，F[5,168]=367.28,p<0.0001）。与shRNA-Sc组相比，shRNA-1使动物SNI术后第7天机械痛阈由0.04±0.009g升高到0.28±0.025g（p<0.05)，并且这种治疗给药方式在术后14天依然能够缓解动物的疼痛，第14天动物机械痛阈值由0.034±0.002g升高到0.43±0.048（p<0.05）。与shRNA-Sc组动物相比，shRNA-2使动物SNI术后第7天机械痛阈值由0.04±0.009g升高到0.31±0.01g（p<0.05），术后第14天动物机械痛阈值由0.034±0.002g升高到0.45±0.067g（p<0.05）。57 军事科学院博士学位论文A1.5NaiveSNISaline+SNI1.0shRNA-Sc+SNIshRNA-1+SNI0.5******shRNA-2+SNI**Withdrawalthreshold(g)0.0Pre-op51015DaysafterSNIB1.5NaiveSNISNI+Saline1.0SNI+shRNA-ScSNI+shRNA-1**0.5**SNI+shRNA-2**Withdrawalthreshold(g)0.0Pre-op51015DaysafterSNI图22鞘内注射VGLUT2shRNA慢病毒对SNI小鼠机械痛阈的影响A图示SNI手术前第7天鞘内注射VGLUT2shRNA慢病毒小鼠机械痛阈变化情况，saline（n=8），shRNA-Sc（n=9），shRNA-1（n=9），shRNA-2（n=10），naive（n=6），SNI（n=6）；B图示SNI术后第4天鞘内注射VGLUT2shRNA慢病毒小鼠机械痛阈变化情况，saline（n=8），shRNA-Sc（n=9），shRNA-1（n=11），shRNA-2（n=8），naive（n=6），SNI（n=6）；mean±SEM，Two-wayANOVA，Bonferronipost-hoctest，*p<0.05与shRNA-Sc比较3.3丘脑VPL脑区注射VGLUT2shRNA慢病毒对SNI小鼠机械痛阈的影响丘脑VPL脑区与神经病理性痛的发生发展密切相关[73,74]，本实验室前期发现小鼠SNI术后丘脑VGLUT2蛋白表达显著上升，因此我们分别于SNI术前或术后将VGLUT2shRNA慢病毒微量注射至小鼠VPL脑区，进一步研究丘脑内58 军事科学院博士学位论文VGLUT2与神经病理性痛的相关性。3.3.1丘脑VPL脑区注射shRNA-VGLUT2在体敲减效果验证如图23A所示，在丘脑VPL所在位置有明显的GFP荧光，表明病毒已成功注射至丘脑VPL脑区并有效表达，将shRNA-Sc、shRNA-1或shRNA-2分别注射到VPL，14天后取材进行westernblot检测，结果表明shRNA-1和shRNA-2均显著下调VPL中的VGLUT2蛋白表达水平（图23B，F[2,23]=17.17,p<0.0001）。与shRNA-Sc相比，shRNA-1和shRNA-2处理分别使VGLUT2下调至71%±6.8%和60%±3.8%（图23C）。图23丘脑VPL脑区注射VGLUT2shRNA慢病毒对VGLUT2蛋白表达的影响A图示丘脑VPL脑区注射VGLUT2shRNA慢病毒后GFP免疫荧光染色结果，DAPI为细胞核染料；B图示丘脑VPL脑区注射VGLUT2shRNA慢病毒14天后蛋白免疫印记检测结果，GAPDH为内参，shRNA-Sc（n=9），shRNA-1（n=8），orshRNA-2（n=9），mean±SEM;One-wayANOVA，Newman-Keulstest，*p<0.05与阴性对照序列shRNA-Sc比较；C图示59 军事科学院博士学位论文图24A图中动物进行完行为学试验所得大脑组织冰冻切片免疫荧光染色结果，VGLUT2（红色），GFP（绿色），Contra（contralateral）是SNI手术对侧；Ipsi（ipsilateral）是SNI手术同侧，图片放大倍数为200×3.3.2丘脑VPL脑区注射VGLUT2shRNA慢病毒对SNI小鼠机械痛阈的影响分别于SNI术前或者术后将VGLUT2shRNA慢病毒微量注射到小鼠VPL脑区。结果显示，SNI手术前第7天给予shRNA-VGLUT2慢病毒，能够显著影响SNI诱导的机械痛敏（图24，F[5,164]=316.4,p<0.0001），与shRNA-Sc组动物相比较shRNA-1使动物SNI术后第4天机械痛阈由0.033±0.008g高升到0.432±0.035g（p<0.05），并维持到至少术后14天，SNI术后第14天动物机械痛阈由0.028±0.006g高升到0.348±0.051g（p<0.05）；shRNA-2使动物SNI术后第4天机械痛阈由0.033±0.008g高升到0.288±0.043g（p<0.05），第14天机械痛阈由0.028±0.006g高升到0.438±0.028g（p<0.05）。于另一组实验中，SNI术后第4天将VGLUT2敲减病毒微量注射至丘脑VPL脑区，术后7、10、14天动物机械痛阈值检测结果显示（图24），术后第4天VPL注射VGLUT2shRNA慢病毒能够显著影响动物的机械痛阈值（F[5,164]=284.93,p<0.0001），与shRNA-Sc组动物相比较shRNA-1使动物SNI术后第7天机械痛阈由0.046±0.005g高升到0.291±0.038g（p<0.05），并维持到至少术后14天，SNI术后第14天动物机械痛阈由0.048±0.01g高升到0.379±0.031g（p<0.05）；shRNA-2使动物SNI术后第7天机械痛阈由0.046±0.005g高升到0.354±0.036g（p<0.05），第14天机械痛阈由0.048±0.01g高升到0.369±0.062g（p<0.05）。ANaive1.5SNISaline+SNIshRNA-Sc+SNI1.0shRNA-1+SNIshRNA-2+SNI0.5********Withdrawalthreshold(g)0.0Pre-op51015DaysafterSNI60 军事科学院博士学位论文BNaive1.5SNISNI+SalineSNI+shRNA-Sc1.0SNI+shRNA-1SNI+shRNA-2**0.5****Withdrawalthreshold(g)0.0Pre-op51015DaysafterSNI图24丘脑VPL脑区注射VGLUT2shRNA慢病毒对SNI小鼠机械痛阈的影响A图示SNI手术前第7天丘脑VPL脑区注射VGLUT2shRNA慢病毒小鼠机械痛阈变化情况，saline（n=8），shRNA-Sc（n=8），shRNA-1（n=9），shRNA-2（n=10），naive（n=6），SNI（n=6）；B图示SNI术后第4天丘脑VPL脑区注射VGLUT2shRNA慢病毒小鼠机械痛阈变化情况，saline（n=8），shRNA-Sc（n=8），shRNA-1（n=10），shRNA-2（n=9），naive（n=6），SNI（n=6）；mean±SEM；Two-wayANOVA，Bonferronipost-hoctest，*p<0.05与shRNA-Sc相比较3.4VGLUT2shRNA慢病毒对谷氨酸释放的影响VGLUT2最重要的生理功能是将囊泡外的谷氨酸转运至囊泡中，进而决定谷氨酸能神经递质的贮存及释放，因此我们分别在细胞水平以及突触体水平对谷氨酸的释放情况进行了研究。3.4.1干扰VGLUT2对原代培养神经元谷氨酸释放的影响在细胞密度一致的原代神经元培养液中分别加入shRNA-Sc、shRNA-1、shRNA-2，14天后检测培养液中谷氨酸浓度，结果如图所示。加入了shRNA-Sc的神经元培养液中谷氨酸浓度为33.82±0.66µM，shRNA-1（20.39±1.17µM）、shRNA-2（18.97±1.09µM）与其相比显著降低（p<0.05），这一结果提示干扰VGLUT2表达可能影响谷氨酸释放。61 军事科学院博士学位论文40M)30**20Glutamate(100shRNA-ScshRNA-1shRNA-2图25VGLUT2shRNA慢病毒对原代神经元培养基中谷氨酸浓度的影响在原代神经元培养基中分别加入shRNA-Sc，shRNA-1，shRNA-214天后对培养基中谷氨酸浓度进行检测，mean±SEM；Student'st-test，*p<0.05与阴性对照序列shRNA-Sc比较，n=33.4.2干扰VGLUT2对脊髓神经突触体谷氨酸释放的影响不同动物鞘内注射shRNA-Sc、shRNA-1或shRNA-2后第7天进行SNI手术，于术后第7天取材提取脊髓突触体，对脊髓突触体谷氨酸释放的检测结果显示，与正常动物相比SNI手术使脊髓突触体谷氨酸释放水平显著升高（7.34±0.42nmol/mgvs.11.94±0.57nmol/mg,p<0.05），在SNI动物中干扰VGLUT2能够降低突触体谷氨酸释放量，且具有显著性差异（p<0.05）（图26）。15*##105GlutamateRelease(nmol/mg)0shRNA-1shRNA-2shRNA-ScshRNA-Sc+NaiveSNI图26鞘内注射VGLUT2shRNA慢病毒对SNI小鼠脊髓突触体谷氨酸释放的影响mean±SEM，One-wayANOVA，Newman-Keulstest，*p<0.05，与shRNA+Naive比较，#p<0.05与shRNA-Sc+SNI比较;每组突触体分别从5只动物中提取获得62 军事科学院博士学位论文3.4.3干扰VGLUT2对丘脑神经突触体谷氨酸释放的影响在两组动物的VPL脑区分别注射shRNA-Sc或shRNA-2后第7天进行SNI手术，于术后第7天取材提取VPL突触体。结果显示在SNI动物中干扰丘脑VPL脑区中的VGLUT2同样能够显著下调VPL突触体中谷氨酸释放量（8.12±0.24nmol/mgvs.7.31±0.21nmol/mg,p<0.05）（图27）。108*6420GlutamateRelease(nmol/mg)shRNA-ScshRNA-2图27丘脑VPL脑区注射VGLUT2shRNA慢病毒对SNI小鼠VPL突触体谷氨酸释放的影响mean±SEM，Studentt-test，*p<0.05与shRNA-Sc比较，每组突触体分别从10只动物中提取获得4小结本部分研究中，通过利用原代培养神经元中验证得到的shRNA-VGLUT2序列，我们发现鞘内或丘脑VPL脑区注射VGLUT2shRNA慢病毒显著缓解SNI所致小鼠机械痛敏，并伴随突触体谷氨酸释放降低。63 军事科学院博士学位论文第三部分神经痛模型动物Wnt/β-catenin信号通路的变化及其在VGLUT2表达调控中的作用研究证实Wnt/β-catenin信号通路与谷氨酸能信号系统密切相关，不仅直接调控谷氨酸转运体及谷氨酸代谢相关蛋白酶，并且影响突触可塑性，进而参与大鼠CCI所致神经病理性痛。BDNF信号通路与神经痛的发生发展密切相关，并且有文献报道BDNF因子是Wnt/β-catenin信号通路的直接靶基因。那么Wnt/β-catenin信号通路及BDNF信号通路是否调控与谷氨酸递质系统密切相关的VGLUT2的表达呢？本部分我们重点研究了Wnt/β-catenin信号通路在细胞以及整体动物水平对VGLUT2蛋白表达的影响，并且通过行为学实验探讨了Wnt/β-catenin信号通路对VGLUT2表达的影响是否参与神经病理性痛的发病机制，同时我们还对BDNF信号通路在脊髓水平是否能够调控VGLUT2的蛋白表达进行了研究。1实验材料1.1实验动物C57BL/6小鼠，雄性，7-8周龄，购自斯贝福（北京）实验动物科技有限公司，SPF级动物，动物合格证号：SCXK（京）2016-0002，每只笼子放置5-6只，饲养环境恒温恒湿，日光灯每12h明暗交替，自由摄食饮水。1.2PC12细胞株大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤。细胞培养液的配方为：10%胎牛血清、10%马血清的DMEM培养液，在37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。1.3质粒β-catenin-CMV-10-3×Flag：β-catenin真核表达质粒1.4实验试剂（与第一、二部分相同的试剂不再重复）1.Wnt/β-catenin信号通路药品XAV939STEMGENTWntagonistSigmaWnt1AbcamWnt3aR&DBDNFPEPROTECH2.抗体64 军事科学院博士学位论文β-cateninCST,9587（1:1000）Wnt1Abcam,ab15251（1:1000）VGLUT1Millipore,MAB5502（1:1000）VGLUT2CST,71555（1:1000）GAPDH北京普利莱（1:1000）β-actin北京普利莱（1:1000）FlagSigma,F3169（1:3000）1.5主要的实验仪器仪器公司或品牌Real-time实时荧光PCR仪AppliedBiosystems发光成像分析仪Kodak尖头50µl注射器上海安亭微量进样器厂VonFrey纤维丝Danmic/USA2实验方法2.1药品配置(1)XAV939：用DMSO将XAV939粉末配置成10mM的储存液，置于-20℃保存。实验开始前将储存液从-20℃取出，待其完全融化之后，用生理盐水配置成0.2mM的鞘内注射液。(2)Wntagonist:称取适量的Wnt激动剂固体，用DMSO配置成10mM的储存液，置于-20℃保存。实验开始前将储存液从-20℃取出，待其完全融化之后，用生理盐水配置成100µM的鞘内注射液。(3)Wnt1:10µg加入100µl含0.01%BSA的PBS溶液中配置成0.1mg/ml的储存液，置于-20℃保存。实验开始前将储存液从-20℃取出，待其完全融化之后，用生理盐水配置成100ng/5µl的鞘内注射液。(4)Wnt3a:2µg加入500µl含0.01%BSA的PBS溶液中配置成4µg/ml的储存液，置于-20℃保存。实验开始前将储存液从-20℃取出，待其完全融化之后，用PC12培养基配置成100ng/ml的细胞孵育液。(5)BDNF:10µg加入100µl含0.01%BSA的PBS溶液中配置成100µg/ml的储存液，置于-20℃保存。实验开始前将储存液从-20℃取出，待其完全融化之后，用生理盐水配置成100ng/5µl的鞘内注射液。65 军事科学院博士学位论文2.2机械痛阈测定具体实验方法参见第一部分2.3SNI模型构建具体实验方法参见第一部分2.4Real-timePCR检测脊髓Wnt基因mRNA水平具体方法见第一部分，引物序列见下表名称引物序列β-actinSense：ACCAACTGGGACGACATGGAGAAAnti-sense：TACGACCAGAGGCATACAGGGACWnt1Sense：TCGGCAAGATCGTCAACCGAAnti-sense：TAGTCGCAGGTGCAGGACTCWnt2Sense：CTGGGTGTGGCTGAGTGGACAnti-sense：TGTTGCAGTTCCAGCGATGCWnt3aSense：GGCGGCTGTAGTGAGGACATAnti-sense：GTGCATGTGACTGGCGATGGWnt5bSense：AGGGCCGAGCTCTCATGAACAnti-sense：CGTGACATTTGCAGGCGACAWnt8bSense：GTATCATGCGGCGCTCAAGGAnti-sense：AGATGGAGCGGAAGGTGTCG2.5蛋白免疫印记检测Wnt1、β-catenin蛋白表达具体实验步骤参见第一部分2.6鞘内注射VGLUT2shRNA慢病毒、XAV939、Wnt激动剂、Wnt1、BDNF具体实验步骤参见第二部分66 军事科学院博士学位论文2.7定量和统计分析GraphPadPrismVersion5(GraphPadSoftware,Inc.,LaJolla,CA,USA)软件用于统计分析。数据均以mean±SEM表示，蛋白免疫印迹检测SNI术后脑区β-catenin蛋白表达实验中，采用Student’st检验；蛋白免疫印迹检测SNI术后不同时间点β-catenin及Wnt1蛋白表达、Real-timePCR检测SNI术后Wnt因子表达实验中，采用单因素方差分析（One-wayANOVA）及Bonferroni后检验；机械痛阈值检测实验中。采用双因素方差分析（Two-wayANOVA）及Bonferroni后检验，p<0.05为具有统计学意义。3实验结果3.1小鼠SNI术后不同时间Wnt/β-catenin信号分子的表达变化3.1.1SNI术后脊髓Wnt/β-catenin信号通路蛋白表达SNI术后不同时间点取脊髓腰膨大段，采用real-timePCR检测Wnt因子表达。结果显示SNI手术使Wnt1mRNA表达发生了显著性的变化（图28，F[2,12]=11.45,p<0.0001），其中第7、14、21天均显著上升（p<0.05）。图28SNI手术对小鼠脊髓Wnt因子mRNA表达的影响mean±SEM，One-wayANOVA，Newman-Keulstest，*p<0.05与Naive组比较，n=3蛋白免疫印迹也得到类似结果，SNI手术使Wnt1蛋白表达水平升高（图29，F[2,10]=9.279,p<0.001）。与假手术组相比，第1、4、7、14、21天Wnt1蛋白水平变化具有显著性差异（p<0.05）。67 军事科学院博士学位论文图29SNI手术对小鼠脊髓Wnt1蛋白表达的影响GAPDH为内参，mean±SEM，One-wayANOVA，Newman-Keulstest，*p<0.05与Sham组动物比较，n=3Wnt因子引起的细胞内的效应主要是由β-catenin蛋白质所承担的，对SNI术后不同时间点中脊髓β-catenin蛋白检测结果显示，SNI手术使β-catenin蛋白表达发生了显著性的变化（F[3,15]=6.312,p<0.001），其中第1、4、7、14、21天显著上升（p<0.05），分别上升了28%±8.6%、36%±12.5%、36%±12.5%、40%±11.9%、45%±14.1%（图30）。图30SNI手术对小鼠脊髓β-catenin蛋白表达的影响GAPDH为内参，mean±SEM，One-wayANOVA,Newman-Keulstest，*p<0.05与Sham组动物比较，n=468 军事科学院博士学位论文3.1.2不同脑区SNI术后β-catenin蛋白表达我们对SNI术后前额皮质、海马、杏仁核、伏隔核、丘脑中的β-catenin蛋白表达情况进行了检测，结果显示，SNI术后第14天前额皮质中的β-catenin显著升，伏隔核、杏仁核中的β-catenin显著降低，而海马、丘脑中的β-catenin没有发生变化（图31）。图31SNI手术14天对小鼠mPFCβ-catenin蛋白表达的影响mean±SEM，Student’st-test，*p<0.05与假手术组动物比较，n=4图32SNI手术14天对小鼠海马β-catenin蛋白表达的影响mean±SEM，Student’st-test，p>0.05与假手术组动物比较，n=4图33SNI手术14天对小鼠杏仁核β-catenin蛋白表达的影响mean±SEM，Student’st-test，*p<0.05与假手术组动物比较，n=469 军事科学院博士学位论文图34SNI手术14天对小鼠伏隔核β-catenin蛋白表达的影响mean±SEM，Student’st-test，*p<0.05与假手术组动物比较，n=4图35SNI手术14天对小鼠丘脑β-catenin蛋白表达的影响mean±SEM，Student’st-test，p>0.05与假手术组动物比较，n=43.2Wnt/β-catenin信号通路对VGLUT1、VGLUT2蛋白表达的影响从上述实验结果我们可以看出，SNI诱导VGLUT2与Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达均显著上升，提示Wnt/β-catenin信号通路很有可能参与生理和病理条件下VGLUT2的表达调控。3.2.1细胞水平Wnt/β-catenin信号通路对VGLUT1、VGLUT2蛋白表达影响为了证明Wnt/β-catenin信号通路与VGLUT1、VGLUT2的调控关系，我们首先在PC12细胞系中对Wnt/β-catenin信号通路能否调控VGLUT2的蛋白表达进行了研究。结果显示，过表达β-catenin能够升高VGLUT1/2的蛋白表达水平；用Wnt3a对细胞进行处理同样能够升高VGLUT1/2的蛋白表达水平；用Wnt/β-catenin抑制剂XAV939对细胞进行处理能够降低VGLUT1/2的蛋白表达水平（图36）。70 军事科学院博士学位论文图36Wnt/β-catenin信号通路对PC12细胞VGLUT1、VGLUT2蛋白表达的影响A图示β-catenin-CMV-10-3×Flag转染PC12细胞48h蛋白检测结果；B图示Wnt3a处理PC12细胞24h蛋白检测结果；C图示XAV939处理PC12细胞24h蛋白检测结果3.2.2脊髓水平Wnt/β-catenin信号通路对VGLUT1/2蛋白表达的影响通过鞘内注射的方法，我们研究了整体动物水平Wnt/β-catenin信号通路对VGLUT1/2蛋白表达的影响，结果显示Wnt激动剂显著升高VGLUT2蛋白表达水平（图37）。图37鞘内注射Wntagonist对小鼠脊髓VGLUT1、VGLUT2、β-catenin蛋白表达的影响鞘内注射Wntagonist6h后收集动物脊髓腰膨大组织进行蛋白免疫印记实验，注射体积为5μl（100µM），mean±SEM，Student’st-test，*p<0.05与对照组比较,n=371 军事科学院博士学位论文我们发现SNI手术使Wnt1表达显著上升，我们将Wnt1鞘内注射到小鼠脊髓中并检测了VGLUT1/2蛋白表达情况，如图38结果显示，Wnt1能够显著升高VGLUT1/2蛋白表达水平。图38鞘内注射Wnt1对小鼠脊髓VGLUT1、VGLUT2、β-catenin蛋白表达的影响鞘内注射Wnt16h后收集动物脊髓腰膨大组织进行蛋白免疫印记实验，注射体积为5μl（100ng），mean±SEM，Student’st-test，*p<0.05与对照组比较,n=3与PC12细胞中的检测结果相一致，鞘内注射XAV939能够显著下调VGLUT1/2的蛋白表达水平。图39鞘内注射XAV939对小鼠脊髓VGLUT1、VGLUT2、β-catenin蛋白表达的影响鞘内注射XAV93924h后收集动物脊髓腰膨大组织进行蛋白免疫印记实验，注射体积为5μl（0.2mM），mean±SEM，Student’st-test，*p<0.05，**p<0.01与对照组比较,n=43.3BDNF对VGLUT1、VGLUT2蛋白表达的影响为进一步研究Wnt/β-catenin信号通路调控VGLUT蛋白表达的具体机制，我们研究了与Wnt/β-catenin信号通路密切相关的BDNF信号通路对VGLUT1、72 军事科学院博士学位论文VGLUT2蛋白表达的影响。鞘内注射BDNF6h后对脊髓中VGLUT1、VGLUT2蛋白表达检测结果显示，BDNF能够升高脊髓中VGLUT1、VGLUT2和β-catenin的蛋白表达。图40鞘内注射BDNF对小鼠脊髓VGLUT1、VGLUT2、β-catenin蛋白表达的影响鞘内注射BDNF6h后收集动物脊髓腰膨大组织进行蛋白免疫印记实验，注射体积为5μl（100ng），n=23.4Wnt/β-catenin信号通路介导的VGLUT2表达调控在神经痛中的作用以上结果显示，首先在SNI小鼠脊髓中Wnt/β-catenin通路信号分子以及VGLUT2蛋白表达均上升，并且不管是在细胞水平还是整体动物水平Wnt/β-catenin通路都能够影响VGLUT2的蛋白表达，那么这种调控在神经病理性痛条件下是否依然存在呢？3.4.1XAV939对SNI小鼠机械痛阈值及VGLUT2蛋白表达的影响在SNI术后VGLUT2蛋白表达显著上升的第七天，我们将XAV939进行了鞘内给药，结果如图41所示，XAV939能够显著影响动物的机械痛阈值（F[2,108]=401.05,p<0.0001），与溶剂对照组相比较给药后2h动物的机械痛阈值开始上升，给药后的4h（0.368±0.052gvs.0.062±0.014g,p<0.05）、6h（0.522±0.071gvs.0.044±0.015g,p<0.01）、8h（0.356±0.05gvs.0.054±0.015g,p<0.05）动物的机械痛阈值显著增加。73 军事科学院博士学位论文Sham+DMSO1.5SNI+DMSOSNI+XAV9391.0**0.5**Withdrawalthreshold(g)0.0-1372468101224PostoperativeAfterinjection(h)day图41鞘内注射XAV939对SNI小鼠机械痛阈的影响注射体积为5μl（0.2mM），mean±SEM，Two-wayANOVA，Bonferronipost-hoctest，*p<0.05，**p<0.01与同一时间点SNI+DMSO组比较，n=5我们分别对给药后第6h、12h小鼠脊髓中β-catenin和VGLUT2蛋白表达进行了检测，结果如图42所示，给药后6h，与假手术组相比较SNI使β-catenin和VGLUT2蛋白表达显著上升，与溶剂对照组相比较XAV939能够显著下调SNI所引起的β-catenin和VGLUT2蛋白表达的升高；给药后12h，与假手术组相比较SNI使β-catenin和VGLUT2蛋白表达显著上升，与溶剂对照组相比较XAV939能够显著下调SNI所引起的β-catenin蛋白表达的升高，而VGLUT2蛋白表达为发生变化。74 军事科学院博士学位论文图42鞘内注射XAV939对SNI小鼠脊髓VGLUT2、β-catenin蛋白表达的影响给药后6h和12h分别取动物腰膨大组织，注射体积为5μ（l0.2mM），mean±SEM，One-way#ANOVA，Newman-Keulstest，*p<0.05与Sham+DMSO组比较，p<0.05与SNI+DMSO组比较，n=33.4.2VGLUT2敲减病毒对Wnt激动剂所致正常动物机械痛敏的影响在鞘内给予VGLUT2shRNA慢病毒的第14天我们将Wnt激动剂鞘内注射到了动物体内，结果如图43所示，鞘内注射Wnt激动剂能够使动物产生机械痛敏，干扰VGLUT2表达能够显著影响Wnt激动剂所引起的机械痛敏（F[3,84]=10.56,p<0.001），与shRNA-Sc相比较shRNA-1使给药后3h（0.214±0.082gvs.0.822±0.131g,p<0.05）、6h（0.272±0.08gvs.0.738±0.132g,p<0.05）、9h（0.218±0.057gvs.0.65±0.122g,p<0.05）动物的机械痛阈值显著上升，shRNA-2使给药后3h（0.214±0.082gvs.0.857±0.131g,p<0.05）、6h（0.272±0.08gvs.0.844±0.079g,p<0.05）、9h（0.218±0.057gvs.0.87±0.118g,p<0.05）动物的机械痛阈值显著上升。75 军事科学院博士学位论文saline+WntagonistshRNA-1+Wntagonist1.5shRNA-Sc+WntagonistshRNA-2+Wntagonist1.0****0.5Wnt**agonistWithdrawalthreshold(g)0.0036912Postinjection(h)图43VGLUT2shRNA慢病毒对Wntagonist所致小鼠机械痛敏的影响鞘内注射VGLUT2shRNA慢病毒第14天鞘内给予Wntagonist，Wntagonist注射体积为5μl（100μM），mean±SEM，Two-wayANOVA，Bonferronipost-hoctest，*p<0.05与同一时间点shRNA-Sc+Wntagonist组比较，n=5-73.4.3VGLUT2敲减病毒对Wnt1所致正常动物机械痛敏的影响在鞘内给予VGLUT2shRNA慢病毒的第14天我们将Wnt1激动剂鞘内注射到了动物体内，结果如图44所示，鞘内注射Wnt1能够使动物产生机械痛敏，干扰VGLUT2表达能够显著影响Wnt1所引起的机械痛敏（F[3,96]=38.21,p<0.0001），与shRNA-Sc相比较shRNA-1使给药后3h（0.744±0.083gvs.0.183±0.026g,p<0.05）、6h（0.684±0.1gvs.0.151±0.028g,p<0.05）、9h（0.667±0.079gvs.0.181±0.029g,p<0.05）、12h（0.783±0.114gvs.0.334±0.064g,p<0.05）动物的机械痛阈值显著上升，shRNA-2使给药后3h（0.629±0.072gvs.0.183±0.026g,p<0.05）、6h（0.743±0.118gvs.0.151±0.028g,p<0.05）、9h（0.906±0.11gvs.0.181±0.029g,p<0.05）、12h（0.826±0.161gvs.0.334±0.064g,p<0.05）动物的机械痛阈值显著上升。76 军事科学院博士学位论文saline+Wnt1shRNA-1+Wnt11.5shRNA-Sc+Wnt1shRNA-2+Wnt11.0*****0.5***Wnt1Withdrawalthreshold(g)0.0036912Postinjection(h)图44VGLUT2shRNA慢病毒对Wnt1所致小鼠机械痛敏的影响鞘内注射VGLUT2shRNA慢病毒第14天鞘内给予Wnt1，Wnt1注射体积为5μ（l100ng），mean±SEM，Two-wayANOVA，Bonferronipost-hoctest，*p<0.05与同一时间点shRNA-Sc+Wnt1组比较，n=74小结在本部分研究中，我们发现SNI术后小鼠脊髓Wnt1和β-catenin表达水平显著升高，与VGLUT2表达变化呈正相关，并且生理条件下影响Wnt/β-catenin信号通路能相应地改变VGLUT1，VGLUT2蛋白表达水平，说明病理条件下Wnt/β-catenin可能通过调控VGLUT2的表达参与神经痛发病机制，Wnt/β-catenin通路抑制剂XAV939通过干扰VGLUT2的表达而抑制神经病理性痛及VGLUT2shRNA慢病毒可对抗Wnt激动剂及Wnt1诱导正常动物产生的机械痛觉过敏的实验结果对此进行了验证。77 军事科学院博士学位论文讨论在本课题中，为探讨VGLUT2在神经病理性疼痛中的作用及其表达调控机制，我们检测了SNI术后不同时间点小鼠脊髓VGLUT2表达变化，结果发现VGLUT2蛋白表达显著上升，术后脊髓背角中VGLUT2主要表达于神经元而不表达于星型胶质细胞和小胶质细胞中；鞘内注射或丘脑VPL脑区微量注射VGLUT2shRNA慢病毒显著升高SNI动物的机械痛阈值，并将伴随突触体谷氨酸释放明显降低；SNI术后脊髓Wnt1和β-catenin表达水平升高；影响Wnt/β-catenin信号通路能够相应的改变VGLUT1，VGLUT2蛋白表达；Wnt/β-catenin通路抑制剂XAV939通过干扰VGLUT2的表达而抑制神经病理性痛；Wnt激动剂以及Wnt1诱导正常动物产生机械痛觉过敏能够被VGLUT2敲减病毒所对抗。神经病理性疼痛是一种由于外周或中枢神经损伤而引起的疼痛感觉紊乱。发生机制与神经递质、神经胶质细胞以及离子通道等因素的变化所致神经元过度兴奋有关。研究神经病理性疼痛的动物模型有很多，例如慢性神经压迫模型（CCI）、脊神经结扎模型（SNL）、坐骨神经部分损伤模型（PSL）等。各种神经痛模型在造模方式、疼痛发生和分子机制等方面有所区别。在本研究中我们采用了由Decoterd和Woolf于2000年建立的SNI模型，此模型特点包括：模型稳定、重复性好；神经病理性疼痛行为表现持久，术后1天动物的机械痛阈值即可显著降低，2周内降到最低，并可持续近6个月；与临床上神经病理性疼痛特点类似；可用于观察周围未损伤神经元以及初级传入神经元损伤变换。该模型还可使动物冷痛阈降低，但是不影响热痛阈。VGLUT2的表达分布特点提示其在伤害性信息传导过程中可能发挥了作用。背根神经节中感受机械刺激和冷刺激的C纤维广泛表达VGLUT2；脊髓中VGLUT2主要表达在兴奋性中间神经元集中的I–II层；丘脑中90%的兴奋性神经元主要表达VGLUT2，并且几乎所有从丘脑投射[75]到大脑皮层中的谷氨酸能神经元都表达VGLUT2。我们前期研究发现SNI术[24]后丘脑等疼痛相关脑区中VGLUT2表达显著上调。本研究发现SNI术后1、4、7、14、21天脊髓VGLUT2蛋白表达上升，其中手术后期（7、14、21天）升高显著，提示脊髓中的VGLUT2可能在神经病理性痛后期的维持阶段发挥更为重要的作用。大量在基因修饰动物中的研究提示VGLUT2与神经病理性痛的发生[23]发展密切相关，VGLUT2敲除的杂合小鼠SNI术后机械痛敏和冷痛敏消失。[21]DRGVGLUT2敲除小鼠神经损伤之后表现出机械痛敏而不表现出热痛敏。这些研究结果一方面说明VGLUT2与神经病理性痛有着密切的关系，另一方面也78 军事科学院博士学位论文说明不同部位的VGLUT2可能在神经病理性痛的具体表现上参与不同方面的作用。我们通过蛋白免疫印记以及免疫组化的实验方法发现在SNI神经病理性痛小鼠脊髓腰膨大部位VGLUT2蛋白表达显著上升，并且通过干扰脊髓中VGLUT2发现SNI所致疼痛症状得到缓解，因此对脊髓VGLUT2与神经病理性痛的相关性进行了验证。腰膨大包含初级传入投射，兴奋性中间神经元和下行兴[76-78]奋性投射，它们都利用谷氨酸作为主要的神经递质。可以推测本研究中发现的SNI小鼠脊髓腰膨大位置上升的VGLUT2至少有一部分来源于初级感觉神经元胞体所在位置既DRG。神经损伤引起的轴浆运输增强为升高的VGLUT2的来[79,80]源问题提供了解释依据。但是，VGLUT2也可能有其它来源，例如原位合[81,82]成以及来自脊髓上部位的轴浆运输。本研究干扰丘脑VPL脑区VGLUT2产生的镇痛效应及其伴随的突触体谷氨酸释放减少，进一步证实了VPL核团中谷氨酸能神经递质的致痛作用。丘脑是疼痛信号转导的中枢站，主要以VGLUT2作为其突触前谷氨酸转运体蛋白。下调VPL脑区中的谷氨酸递质水平或谷氨酸[83,84]受体功能显著抑制神经病理性痛。本研究所得到的结果与我们之前发现SNI术后丘脑中VGLUT2表达上调共同验证了丘脑VGLUT2在神经病理性痛中的重要作用。对于解释脊髓中升高的VGLUT2是如何发挥其促进神经病理性痛作用的，可以从神经病理性痛条件下VGLUT2的表达变化究竟源于哪些细胞这个问题入手。神经元兴奋性增强是导致神经病理性痛的直接因素，同时胶质细胞通过影响神经元活性而对神经病理性痛进行调控。VGLUT2决定谷氨酸的储存与释放，通常被认为主要表达于谷氨酸能神经元，但也不能排除某些病理条件下VGLUT2在其他细胞表达的可能性。关于生理条件下胶质细胞是否表达VGLUT2一度存在争议。2004年Montana等人通过蛋白免疫印迹实验发现原代分离得到的视觉[85]皮质星形胶质细胞中含有VGLUT2;同一年Bezzietal在通过电生理方法发[86]现的海马星形胶质细胞中发现了VGLUT2mRNA的表达；Crippa团队于2006年发现在混合培养的海马胶质细胞中分离得到的synaptobrevin2表达的囊泡中含[87]有VGLUT2表达；2010年Platel等发现在纹状体和海马中含有VGLUT2与谷氨酸-天冬氨酸转运体GLAST（一种星形胶质细胞的标志物）的共定位情况，[88]而这种共定位却没有在RMS和SVZ这两个脑区中发现。有许多其它研究者也未能发现VGLUT2在胶质细胞中表达：有研究者在2008通过免疫荧光双重标记实验发现,在丘脑VP脑区VGLUT2与四个胶质细胞地标志物（MBP,mOSP,[89]NG2,GFAP）并不存在共定位地情况；2013年一项结论性的研究证实之前发现的胶质细胞中VGLUT2表达是抗体假阳性所导致的，他们发现在79 军事科学院博士学位论文VGLUT2-EGFP转基因小鼠与正常野生型小鼠相比较并不表现出更强地EGFP信号，并且从野生型小鼠或者VGLUT2杂合小鼠以及全敲小鼠丘脑中分离得到的星形胶质细胞与神经元混合物并不表达特异地VGLUT2荧光信号，丘脑中[90]VGLUT2与星形胶质细胞也并不存在共定位现象。2009年，Ni研究团队发现[91]在原代分离得到的星型胶质细胞中过表达VGLUT2并不影响谷氨酸的释放。以上研究说明，至少在生理条件下VGLUT2不表达于胶质细胞中，本研究对SNI术后小鼠脊髓背角中VGLUT2细胞定位情况进行了检测，结果表明在神经病理性痛这一病理条件下VGLUT2同样只表达于神经元而不表达于胶质细胞中，说明在SNI神经病理性痛条件下VGLUT2主要在神经元而非胶质细胞中发挥作用进而参与疼痛的形成。由于本研究发现干扰脊髓及丘脑VPL脑区中的VGLUT2能抑制相应部位突触体谷氨酸释放，所以我们能得出这样的假设，VGLUT2的升高使得神经元突触前膜中更多的谷氨酸被转运到突触囊泡中，进而使得释放到突触间隙的谷氨酸含量升高，神经元兴奋性增强，疼痛信号被放大而产生痛敏。[84,92]中枢及外周谷氨酸能信号系统增强是神经病理性疼痛的重要机制。以往的研究主要围绕谷氨酸质膜转运体（EAAT）、谷氨酸代谢相关酶以及谷氨酸受体在神经痛中的作用。研究证实，神经损伤后，脊髓中谷氨酸受体及EAAT的表达、分布、功能都会发生变化，这些变化导致谷氨酸能神经传递的增强进而引起[93][94]疼痛行为；改变外周及脊髓、脊髓上谷氨酸能信号水平可影响神经病理性痛。[95]研究表明，SNI术后胞外谷氨酸释放增加；神经损伤使脊髓及一些脑区中EAATs表达发生变化，导致谷氨酸重摄取及清除过程发生失衡，进而诱发神经[96]病理性疼痛。本课题主要围绕位于突触前囊泡膜上负责转运谷氨酸的VGLUT2蛋白与神经病理性痛的相关性进行研究。第一部分结果显示SNI术后脊髓VGLUT2表达升高，我们之前也发现SNI术后丘脑VGLUT2表达升高，并且脑室给予VGLUTs抑制剂CSB6B显著缓解疼痛并下调丘脑突触体谷氨酸释放，提示VGLUTs也参与了谷氨酸所介导的突触增强过程。然而由于CSB6B对三种VGLUT亚型均有抑制作用，神经病理性疼痛过程中VGLUT2的表达变化与谷氨酸释放的关系依然不明确。本部分通过RNA干扰技术特异性下调VGLUT2表达，发现鞘内注射或者丘脑VPL脑区给予shRNA-VGLUT2能够有效缓解SNI所引起的机械痛敏，并且shRNA-VGLUT2显著降低原代培养神经元以及突触体中谷氨酸的释放。丘脑中VGLUT2表达占绝对优势，痛觉信号传导的中枢机制与丘[97,98]脑谷氨酸能神经递质密不可分。在VGLUT2全身性敲除杂合动物中丘脑神[23][99]经元mEPSC的振幅下降50%，而VGLUT过表达将增加囊泡的量子式释放。丘脑VPL脑区中的神经终末起源于脊髓背角，丘脑-皮质神经投射到VGLUT280 军事科学院博士学位论文[89]高表达的皮质第IV板层。丘脑VPL脑区是脊髓丘脑束链接的最终部位，其接[100]受脊髓传递过来的信号后再将信号传导至初级体表感觉皮质。研究表明，在动物神经痛模型中，VPL脑区对伤害性刺激的反应超敏是机械痛敏形成的重要[101]机制；给予动物足底伤害性刺激使VPL脑区谷氨酸的释放量增加而镇痛药物[102,103]能够抑制此效应；在VPL脑区下调谷氨酸的水平或者阻断谷氨酸受体的[83,84]作用能够有效缓解神经损伤引起的疼痛。本部分研究发现干扰VPL脑区中的VGLUT2能够有效缓解动物的神经病理性痛症状，并且能够降低突触体谷氨酸释放。CSB6B通过与VGLUT胞内外区域结合，阻碍其跨膜孔道，进而抑制VGLUT[104]的功能而不影响质膜谷氨酸转运体。前期研究表明，抑制VGLUTs的功能可以明显减弱SNI、奥沙利铂，建立化疗药致神经痛模型所形成的机械痛敏。由于CSB6B对VGLUTs的三个亚型没有选择性，基因敲除技术虽然很好了解决了特异性的问题，近年来，有研究人员通过基因改造的方式对VGLUT2在神经病理性疼痛中的作用进行了研究，但是VGLUT2全敲动物不能存活至成年，因此用于行为学研究的主要是VGLUT2杂合子或条件性敲除动物。研究表明，VGLUT2杂合子小鼠SNI术后对机械刺激和冷刺激的痛觉过敏消失，而运动能力、学习[22,23]记忆、快痛及炎症性疼痛并不受影响。进一步的研究表明VGLUT2表达降[23]低将减弱丘脑神经元兴奋性突触后电流幅度及频率。对外周神经系统VGLUT2的相关研究发现，完全弗氏佐剂使大鼠牙髓VGLUT2的表达明显升高[105]，背根神经节神经元VGLUT2条件性敲除动物对炎性痛及急性痛反应性下降[21]。这些结果提示中枢及外周VGLUT2在疼痛信息的传递与调控中发挥了重要作用。虽然基因敲除技术为揭示VGLUT2在神经病理性疼痛中的作用提供了有效的证据，但是这一技术操作阶段始于胚胎时期，这就将引起机体的代偿性适应，而且这一技术操作难度大的特点就决定了其很难运用于临床。近年来，RNA干扰技术发展迅速，该技术能够有效的特异性抑制靶基因的表达，为靶向治疗提供了全新的思路。在研究中，基于慢病毒载体的以下优点我们选择其作为shRNA-VGLUT2的包装病毒，首先，慢病毒能够感染原代培养神经元等许多其它载体不能感染或很难感染的细胞，而本实验主要靶向是神经元细胞以及体外培养的原代神经元细胞。其次，慢病毒能够实现稳定转染，它能高效地将外源的基因整合入细胞的基因组内进而实现长期的稳定性表达。最后，慢病毒是艾滋病祸首HIV的一种复制缺陷型的逆转录病毒，它具备高效感染细胞的能力的同时却不能进行自我复制，故在安全性上也是有很高的保障。因此我们选取了既能有效感染细胞又能高效感染动物的慢病毒作为重组质粒的包装载体。本81 军事科学院博士学位论文部分研究共体外设计并合成了3条特异性针对VGLUT2的shRNA序列，通过体外原代培养的小鼠全脑神经元上的初步筛选，得到两条有效下调神经元内VGLUT2表达的shRNA序列，为后续在体动物实验提供了确凿可靠的证据。将慢病毒包装得到的shRNA-VGLUT2单次注射到脊髓及丘脑VPL脑区能够对相应位置的VGLUT2进行有效的干扰，从而进一步揭示了脊髓及脊髓上位置VGLUT2在神经病理性痛中的重要作用。但从结果中可以看到无论是在脊髓还是在VPL脑区给予shRNA-VGLUT2都不能将SNI所引起的动物的机械痛阈值恢复到正常动物水平，这一结果的原因有可能是VGLUT2敲减病毒的干扰效果欠佳所引起的；也有可能是敲减VGLUT2之后动物的代偿性适应所导致的，比如敲减脊髓中VGLUT2之后使得VGLUT1代偿性升高；还有可能是因为神经病理性痛发病机制本身的复杂性所引起的，例如除了VGLUT2之外其它神经递质或者信号分子同样可能参与到这一过程当中，因此VGLUT2是如何被调控的或者说VGLUT2与参与神经病理性痛的其它信号通路之间的关系是什么将是一个非常值得回答的问题。研究表明，Wnt/β-catenin通路的异常与神经病理性痛等多种神经系统疾病相[106]关。Wnt/β-catenin通路在神经分裂症患者大脑中处于异常激活的状态，相反[107]在阿尔兹海默症中却处于低表达水平，脊髓挫伤同样会导致多种Wnt因子的[108]变化。已有文献报道，在CCI或骨癌诱发的神经痛动物的DRG和脊髓中Wnt3[65]因子及β-catenin表达升高。而本研究在SNI术后不同时间点检测则发现各种Wnt因子中主要是Wnt1显著升高。这一差异可能与动物模型有关。虽然CCI和SNI都是常用的神经病理性痛模型，但是二者存在多方面的差异，首先SNI起效时间更早，往往术后12h便能出现显著的疼痛反应，而CCI要在术后3天左右才能表现出疼痛反应，其次SNI主要变现为机械痛敏和冷痛敏，而CCI主要表现是机械痛敏和热痛敏。不同神经病理性痛模型之间存在的差异说明引起不同类型神经痛的机制是有区别的，我们的研究结果也证实了这一点，我们发现在SNI模型中Wnt1是显著变化的因子，而CCI模型中起主要作用的是Wnt3a。研究证明，Wnt/β-catenin通路通过调控炎性因子TNF-α或者神经原性营养因子的表达[65,66]进而参与神经病理性痛。本研究发现Wnt/β-catenin通路能够通过调控VGLUT2的表达进而参与到神经痛中。这一结果说明Wnt/β-catenin信号通路参与神经痛的机制是复杂多样的，我们的研究结果不仅为VGLUT2在SNI术后脊髓中的表达升高找到了可能的调控机制，而且为解释Wnt/β-catenin信号通路参与神经病理性痛过程提供了新的证据。另外本研究发现鞘内注射BDNF能够升高VGLUT1、VGLUT2的蛋白表达。82 军事科学院博士学位论文有研究报道，在原代培养的海马神经元中，BDNF能够通过转录及翻译依赖的机制上调VGLUT1、VGLUT2的蛋白表达；这种激活效应依赖于TrkB受体及其下游PLCγ信号通路的激活，而不依赖于PI3-K/Akt和Ras-ERK信号通路的激活；BDNF处理30min及3h能够显著升高VGLUT1在神经元突起中的表达，而只有处理3h能显著升高VGLUT1在神经元胞体中的表达；BDNF处理30min及6h能够显著升高VGLUT2在神经元突起中的表达，而处理30min及6h都不影[40]响VGLUT2在神经元胞体中的表达。另有文章报道，在原代分离得到的DRG[41]细胞中BDNF能够调控VGLUT3的表达。由于脊髓中BDNF信号通路在神经病理性痛中的作用早有报道，因此我们推测BDNF信号通路对VGLUT2的调控很有可能在神经病理性痛中具有重要的作用。Wnt/β-catenin信号通路与谷氨酸能信号系统密切相关，β-catenin能够正向调控[57]EAAT2和GS的mRNA及蛋白表达；Wnt5a能够促进神经元表面谷氨酸NMDA受体亚基GluN2B的分布；Wnt5a还能够增强谷氨酸受体所依赖的兴奋性突触后电位的增强。本部分研究中，我们发现在PC12细胞中，用Wnt3a对细胞进行处理能够升高VGLUT1、VGLUT2的蛋白表达；Wnt/β-catenin抑制剂XAV939能够下调VGLUT1、VGLUT2的蛋白表达。在整体动物水平，鞘内注射Wnt激动剂、Wnt1能够升高脊髓中VGLUT1、VGLUT2的蛋白表达；鞘内注射XAV939将抑制VGLUT1、VGLUT2的蛋白表达。上述结果表明Wnt/β-catenin信号通路可通过调控VGLUT表达影响谷氨酸能神经传递。虽然其中具体调控机制尚不明确，但是我们推测可能与BDNF信号通路相关，因为之前有报道BDNF是Wnt/β-catenin信号通路一个新的靶基因，并且在神经病理性痛中Wnt/β-catenin信号通路能够促进胶质细胞释放BDNF。因此我们猜测，在神经病理性疼痛中：一方面，Wnt/β-catenin信号通路通过BDNF信号通路对VGLUT2表达进行调控；另一方面，由于我们发现鞘内注射BDNF能够升高脊髓β-catenin蛋白水平，说明可能存在正反馈的调控作用，即神经痛中升高的β-catenin使胶质细胞释放的BDNF升高，BDNF作用到神经元或神经胶质细胞中增加胞质中β-catenin的含量，进而升高神经元中VGLUT2蛋白表达水平。此外，我们发现（结果未展示），SNI术后各时间点脊髓VGLUT2mRNA并没有发生明显变化，之前也有研究发现神经损伤和足底炎症不影响VGLUT2的[109]的转录水平，因此SNI术后VGLUT2蛋白表达的升高很有可能是翻译后修饰调控的结果。另外，有研究证实VGLUT2蛋白合成之后被高效地转运到轴突末端行驶转运体的功能而基本不停留在神经元胞体中，此后其mRNA的合成也很少，可以想象对于VGLUT2蛋白这一特点，翻译后修饰为保证VGLUT2在轴突83 军事科学院博士学位论文末端进行功能调控提供了便利条件。综上，本课题不但通过检测神经病理性痛发展过程中VGLUT2随时间的变化情况为干预VGLUT2进行神经痛治疗的给药时间提供了可靠依据，通过RNA干扰方法将脊髓和丘脑中的VGLUT2在神经痛中的作用进行了进一步验证，为特异性干扰VGLUT2提供了有效的工具，并且本研究首次发现Wnt/β-catenin信号通路在生理及病理状态下能够对VGLUT2表达进行调控，从而进一步丰富了VGLUT2的调控机制探究且对神经病理性痛的机制研究具有重要意义。84 军事科学院博士学位论文结论神经病理性疼痛使小鼠脊髓和丘脑VGLUT2蛋白表达升高，敲减脊髓或丘脑VGLUT2缓解疼痛表现，提示脊髓和脊髓上VGLUT2在神经痛病理性痛中具有重要作用。VGLUT2表达变化通过影响谷氨酸释放而调控疼痛行为。神经病理性疼痛条件下，Wnt/β-catenin信号通路正向调控VGLUT2蛋白表达，且与神经病理性痛发生发展相关。本研究揭示了神经病理性痛的突触前机制，为VGLUT2靶向治疗药物研究提供了理论依据。85 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军事科学院博士学位论文主要简历一、基本情况姓名：张志玲性别：女民族：汉出生年月：1988年8月籍贯：江西政治面貌：预备党员通讯地址：北京市海淀区太平路27号院二、个人经历2007.9-2011.6首都师范大学理学学士生物科学2012.9-2015.6首都师范大学理学硕士生物化学与分子生物学（萧伟教授）2015.9-2018.6军事科学院理学博士药理学（苏瑞斌研究员）三、博士期间（待）发表的文章Zhi-LingZhang,GangYu,Xiao-NanLiang,Rui-BinSu,Ze-HuiGong.Selectivedownregulationofvesicularglutamatetransporter2inventralposterolateralnucleusofthalamusattenuatesneuropathicmechanicalallodyniainmice.EurJPharmacol.2018Mar29;828:103-109.Wnt1/β-cateninSignalingUp-regulatesSpinalVGLUT2ExpressiontoMaintainNeuropathicPaininMice(Inpreparation)97 军事科学院博士学位论文致谢在本次论文写作完成过程中，得到了很多导师和同学的帮助，我深受感动。在即将完成博士研究生的学业之际，借此机会，向曾给予我指导、支持和帮助的老师和同学们表达我最诚挚的谢意。感谢我的导师苏瑞斌老师，本课题从选题、实施到取得阶段性成果都得到了苏老师的大力支持。在课题选择和问题解决过程中，苏老师以敏锐的学术洞察力和深厚的科研经验，高屋建瓴地为我论证把关。苏老师在百忙之中坚持与我们进行文献学习以及课题讨论，每次讨论中，苏老师总能为我繁乱的思绪抽丝剥茧，为我指明前进的方向。回首自己这三年在科研领域取得的每一滴进展都凝集了老师的汗水。没有苏老师的指导与帮助，我的研究工作不可能顺利完成。苏老师严谨的治学态度、以及掌握全局的学术思维，令我受益匪浅。感谢我的指导老师俞纲老师，我深深的感受到俞老师对我的悉心指导。难以忘怀自己一次次在课题研究工作中陷入迷茫的时候，是老师的开导与点拨帮助我克服重重困难。俞老师经常利用自己的休息时间帮助我修改发表文章、毕业论文等。俞老师认真、严谨的科研态度以及发自内心对科研工作的热爱时常感染着我。感谢宫泽辉老师在课题立题以及论文修改上给于的帮助。宫老师对待学术研究一丝不苟、精益求精的治学态度令人钦佩，宫老师对专业理论深入浅出的理解及对研究方向精准的把握令人赞叹。感谢董华进老师、颜慧老师、雍正老师、彭英老师、洪葵老师在动物实验中给与的帮助。感谢谭博老师、李玉蕾老师、周培岚老师、曹燕卿老师在细胞及分子实验中的大力支持。感谢王芹老师对实验室整洁环境的辛勤付出。感谢梁晓南博士、代威博士、刘梦博士、廉靖靖博士、刘可硕士、杨怿硕士、彭静博士、孙毅博士、张晓琳硕士、邵帅博士、张艺馨博士、陈光博士、高翔博士、楚浩文硕士、王唤白硕士、王震硕士、徐子琪硕士，感谢你们在这三年的学习生活中对我的陪伴、帮助与包容，感谢你们在实验上给与我的有求必应的帮助，与你们在一起的三年时光将是我人生中难忘的一段经历。同时感谢王志桐硕士、陈园硕士对本课题的帮助。感谢我的父母、哥哥一直以来对我的关心以及支持，是你们无限的包容、鼓励与支持才使得我有勇气面对挫折并不断成长。张志玲2018年5月98