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分类号：Ｒ６９２．３单位代码：１０１８３２０１４７４４０２０：研究生学号密级：公开．⑩吉林大学硕士学位论文（专业学位）吸烟与ＩＭＮ临床病理变化及外周血ＢＡＦＦｍＲＮＡ关系的研究Ｓｔｕｄｏｎｔｈｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｂｅｔｗｅｅｎｓｍｏｋｉｎａｎｄｃｌｉｎｉｃｏａｔｈｏｌｏｉｃ、ｙｐｇｐｇＢＡＦＦｍＲＮＡｉｎａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈＩＭＮｐ作者姓名：王旭类别：临床医学硕士领域：（方向）内科学指导教师：卢雪红教授培养单位：第二医院２０１７年１１月 吸烟与ＩＭＮ临床病理变化及外周血ＢＡＦＦｍＲＮＡ’关系的研究ＳｔｕｄｙｏｎｔｈｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎｓｍｏｋｉｎｇａｎｄｍＲＮＡｉｃａｏｏｉｃｉｎａｉｔｓｗｈＩＭＮｌｉｎｉｃｏｐｔｈｌｇ、ＢＡＦＦｐｔｅｎｔ作者姓名：王旭领域（方向）：内科学指导教师：卢雪红教授类别：临床医学硕士答辩日期：２０１７年１１月２１日 未经本论文作者的书面授权，依法收存和保管本论文书面版本、电子版本的任何单位和个人，均不得对本论文的全部或部分内容进行任何形式的复制、修改、发行、出租、改编等有碍作者著作权的商业性使用（但纯学术性使用不在此限）。否则，应承担侵权的法律责任。吉林大学硕士学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交学位论文，是本人在指导教师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：ｉＭ－Ｚ＾ｔ７日期／年丨月＾日 中文摘要吸烟与IMN临床病理变化及外周血BAFFmRNA关系的研究目的：1、调查特发性膜性肾病（IMN）患者的吸烟状态，分析IMN患者吸烟与临床病理指标的关系，探讨吸烟对IMN的影响。2、检测成人IMN患者外周血单个核细胞B淋巴细胞活化因子（BAFF）mRNA表达水平，探讨吸烟对其表达的影响及其在IMN发病机制中的意义。方法：1、纳入2014年01月至2017年03月间318例经皮肾穿刺活检病理确诊为IMN的患者，所有入选患者的临床及病理资料完整，记录患者的年龄、性别等一般资料及血尿素氮、血肌酐、血白蛋白、血甘油三脂、血胆固醇、空腹血糖、血红蛋白、24小时尿蛋白定量等重要的实验室指标并计算肾小球滤过率（estimatedglomerularfiltrationrate，eGFR）。依据美国疾病控制和预防中心的标准，通过问卷方式调查IMN患者的吸烟状况。肾脏病理的病变程度采用半定量评分方法评价。2、收集2016年09月至2017年03月经皮肾穿刺活检病理明确的成人IMN患者43例，其中吸烟者17例，非吸烟者26例，另外健康对照者35例。所有入组患者均有完整病历记载以及临床病理资料，采集早晨空腹静脉血，用Real-timePCR方法检测人外周血单个核细胞BAFFmRNA的表达水平；应用统计学方法进行对比分析。结果：1、318例特发性膜性肾病患者中吸烟者83例，占26.1%，吸烟者吸烟年限在5年～40余年，其中男性72例，女性11例，男性吸烟率为37.1%，显著高于女性（8.9%）。吸烟者发病年龄分布在32～76岁，平均年龄为51.87±10.09岁，青年组吸烟率为20%，中年组吸烟率为30.8%，老年组吸烟率为25%，差异无统计学意义（P＞0.05）。目前仍在吸烟者61例，占19.2%，其中男性52I 例，女性9例，男性目前吸烟率为26.8%，女性目前吸烟率为7.3%，差异有统计学意义（P<0.01）。83例吸烟者中戒烟者22例（26.5%），其中男性20例，女性2例，男性戒烟率（27.8%）与女性戒烟率（18.2%）之间差异无统计学意义（P＞0.05）。戒烟者全部为中老年，年龄分布在47～63岁。54例回访者中，患病是戒烟的主要原因，吸烟相关肾损害知晓者仅11例。2、吸烟组与非吸烟组相比，eGFR水平较低，差异有统计学意义（P<0.05），肾间质血管总分、肾小管萎缩评分、血管壁增厚评分增高，差异有统计学意义（P<0.05）。3、单因素相关性分析显示：eGFR与年龄、24h尿蛋白定量、收缩压呈负相关，与吸烟无明显相关。进一步多因素回归分析发现eGFR与年龄、24h尿蛋白定量呈负相关。4、单因素相关性分析显示：间质血管总分与吸烟、年龄、收缩压、舒张压呈正相关。进一步多因素回归分析发现间质血管总分与吸烟、年龄呈正相关。5、IMN患者中吸烟组BAFFmRNA表达水平（2.54±0.90）与非吸烟组（2.21±0.95）相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。6、IMN组BAFFmRNA表达水平（2.37±0.98）显著高于健康对照组（1.75±0.48），差异有统计学意义（P<0.05），且BAFFmRNA表达水平与24h尿蛋白定量呈正相关。结论：1、IMN患者中吸烟率为26.1%，男性吸烟率高，吸烟者戒烟率为26.5%，吸烟相关肾损害知晓率低。2、吸烟对IMN患者肾功能具有一定的损害作用，是IMN肾间质血管损伤的重要危险因素。3、BAFFmRNA的高表达可能在IMN的发病机制中发挥重要作用，而吸烟对IMN患者体内BAFFmRNA的表达无明显影响。关键词：特发性膜性肾病，吸烟，B淋巴细胞活化因子II AbstractStudyontherelationshipbetweensmokingandclinicopathologic、BAFFmRNAinpatientswithIMNObjective:1、Toinvestigatethesmokingstatusinpatientswithidiopathicmembranousnephropathy（IMN），analyzetherelationshipbetweensmokingandclinicopathologicalindexes，discusstheeffectofsmokingonIMN.2、ToexaminetheexpressionofBAFFmRNAinperipheralbloodmononuclearcells（PBMCs）ofpatientswithIMN，investigatetheeffectofcigarettesmokingonitsexpressionandthesignificanceinthepathogenesisofthisdisease.Methods:1、Selected318casesofidiopathicmembranousnephropathypatientsconfirmedbyrenalbiopsyfromJanuary2014toMarch2017，alltheenrolledpatientshavecompletemedicalrecords,Clinicalandpathologicaldata.Allcaseswererecordrdgeneraldata，suchasage，gender，andserumureanitrogen、serumcreatinine、serumalbumin、triglyceride、serumcholesterol、fastingglucose、hemoglobin、24-hoururinaryproteinetcandestimateeGFR.WegottheinformationonsmokingstatusfromthepatientsthroughaquestionnairesurveyaccordingtothestandardofCDC.Usingsemi-quantitativescoringsystemforrenalinterstitiumandbloodvessels.2、Selected43casesofidiopathicmembranousnephropathypatientsconfirmedbyrenalbiopsyfromSeptember2016toMarch2017，therewere17smokersand26non-smokers,and35casesofhealthycontrols,alltheenrolledpatientshavecompletemedicalrecords,Clinicalandpathologicaldata.Allobjects'morningfastingserumsampleswerecollected.ExpressionofBAFFmRNAinperipheralbloodmononuclearcells（PBMCs）of43IMNpatientsand35healthycontrolswasdeterminedbyreal-timePCR.Alldatawereanalyzedwiththemethodsofstatistic.III Results:1、Therewere83casesofsmokersin318patientswithidiopathicmembranousnephropathy,smokingratewas26.1%,thelengthofsmokingwas5yearsto40years,therewere72malesand11females,themalesmokingratewas37.1%,significantlyhigherthanthatoffemale8.9%,thedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.01).Theageatonsetofsmokerswere32~76yearsold,theaverageagewas51.87±10.09yearsold.Thesmokingrateofyounggroupwas20%,middle-agedgroupwas30.8%,andoldgroupwas25%,thedifferencewasnotstatisticallysignificant.Therewere61currentsmokers,accountingfor19.2%,including52malesand9females.thecurrentsmokingrateofmenis26.8%,andwomenis7.3%,thedifferenceisstatisticallysignificant(P<0.01).Amongthe83smokers,22caseswereformersmokers(26.5%),including20malesand2females.Thequitesmokingrateofmale(27.8%)wasnotsignificantlydifferentfromthatoffemale(18.2%).Allformersmokersweremiddle-agedandold,theagerangesfrom47to63.Amongthe54patientswhoreceivedavisit,thediseasewasthemaincauseofsmokingcessation.Only11patientswereawareofsmokingrelatedkidneydamage.2、Smokinggroupcomparedwithnonsmokinggroup,theeGFRlevelwaslower,andthetotalscoresofrenalinterstitialvessels,tubularatrophyandthickeningofvesselwallwerehigher.thedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.05).3、SinglefactorcorrelationanalysisshowedthateGFRwasnegativelycorrelatedwithage,24hurineproteinquantitateandsystolicbloodpressure,nosignificantassociationwithsmoking.FurthermultivariateregressionanalysisshowedthateGFRwasnegativelycorrelatedwithageand24hurineprotein.4、Singlefactorcorrelationanalysisshowedthatthetotalscoresofrenalinterstitialvesselswerepositivelycorrelatedwithage,smoking,systolicbloodpressureanddiastolicbloodpressure.Furthermultivariateregressionanalysisshowedthatthetotalscoresofrenalinterstitialvesselswerepositivelyrelatedtoageandsmoking.IV 5、InIMNpatients,theexpressionlevelofBAFFmRNAinsmokinggroup(2.54±0.90)wasnotstatisticallysignificantcomparedwithnonsmoking(2.21±0.95).6、InIMNpatients,theexpressionofBAFFmRNAinperipheralbloodmononuclearcellswassignificantlyup-regulatedinIMNpatients（2.37±0.98）comparedtoHC（1.75±0.48）.TheexpressionlevelofBAFFmRNAwaspositivelycorrelatedwiththe24hurineprotein.Conclusion:1、InIMNpatients,smokingratewas26.1%,malesmokingratewashigh,smokersquitsmokingratewas26.5%,smokingrelatedkidneydamageawarenessratewaslow.2、SmokingplaysacertainroleintheimpairmentofrenalfunctioninpatientswithIMN,andisanimportantriskfactorforIMNtubulointerstitialandvascularlesions.3、Up-regulatedexpressionofBAFFmRNAmaybeinvolvedinthepathogenesisofIMN.SmokinghasnosignificanteffectontheexpressionofBAFFmRNAinIMNpatients.Keywords:Idiopathicmembranousnephropathy，smoking，BAFFV 目录中文摘要......................................................................................................IABATRACT..................................................................................................III目录........................................................................................................VI中英文缩略词...........................................................................................Ⅸ第1章引言...........................................................................................11.1背景及意义....................................................................................11.2IMN发病机制的研究进展.............................................................21.2.1Heymann肾炎模型..................................................................31.2.2中性肽链内切酶.....................................................................31.2.3特发性膜性肾病患者体内淋巴细胞的变化.........................41.2.4M型磷脂酶A2受体..................................................................41.2.5醛糖还原酶和超氧化物歧化酶-2抗体................................61.2.6α-烯醇化酶...........................................................................61.2.7阳离子化牛血清白蛋白.........................................................61.2.8THSD7A抗体............................................................................71.3IMN治疗进展.................................................................................81.3.1保守治疗.................................................................................81.3.2激素和（或）免疫抑制治疗.................................................91.3.3利妥昔单抗...........................................................................11VI 1.3.4促肾上腺皮质激素...............................................................121.3.5中药治疗...............................................................................12第2章资料和方法...............................................................................142.1研究对象及标本收集..................................................................142.2主要试剂及器材..........................................................................142.3实验步骤......................................................................................152.3.1临床资料...............................................................................152.3.2病理资料...............................................................................152.3.3诊断及调查评分标准...........................................................152.3.4人外周血单个核细胞（PBMC）的分离...............................162.3.5Trizol一步法提取总RNA...................................................172.3.6逆转录成cDNA......................................................................172.3.7实时荧光定量检测PBMC中BAFFmRNA表达.......................172.4统计学分析..................................................................................18第3章结果...........................................................................................193.1一般资料......................................................................................193.2特发性膜性肾病患者吸烟现状..................................................193.3吸烟和非吸烟IMN患者临床资料分析......................................203.4吸烟和非吸烟IMN患者病理资料分析......................................223.5IMN患者eGFR的单因素相关性分析.........................................233.6IMN患者肾间质血管病变的单因素相关性分析.......................24VII 3.7与IMN患者eGFR相关因素的多重回归分析..............................253.8与IMN患者肾间质血管病变相关因素的多重回归分析...........253.9Real-timePCR法检测β-antin及BAFFmRNA结果..................253.10吸烟组和非吸烟组IMN患者中BAFFmRNA表达........................273.11IMN组和正常对照组中BAFFmRNA表达.....................................273.12BAFFmRNA的表达与24h尿蛋白定量的关系.............................27第4章讨论.........................................................................................284.1一般资料讨论................................................................................284.2IMN患者吸烟状态讨论.................................................................284.3临床资料讨论................................................................................294.4吸烟对IMN患者肾功能影响分析................................................304.5吸烟对IMN患者肾脏病理影响分析............................................304.6BAFFmRNA在IMN患者体内表达分析...........................................31第5章结论.........................................................................................34参考文献....................................................................................................35作者简介及在学期间所取得的科研成果...............................................42致谢........................................................................................................43VIII 中英文缩略词缩略词英文全称中文全称MNMembranousNephropathy膜性肾病IMNIdiopathicMembranousNephropathy特发性膜性肾病SMNSeconderymembranousnephropathy继发性膜性肾病BAFFB-cellactivatingfactorbelongingtotumorB细胞活化因子necrosisfactorfamilyPBMCPeripheralbloodmononuclearcell外周血单个核细胞NEPNeutralendopeptidase中性肽链内切酶PLA2RPhospholipaseA2receptor磷脂酶A2受体sPLA2secretory-PLA2分泌型PLA2ARAldosereductase醛糖还原酶SOD2Manganesesuperoxidedismutase锰超氧化物歧化酶BSACationicbovineserumalbumin牛血清白蛋白THSD7AThrombospondinType-1domain-containing7A1型血小板反应蛋白7A域ACEIAngiotensinConvertingEnzymeInhibitors血管紧张素转化酶抑制剂ARBAngiotensinⅡReceptorBlocker血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂MMFMycophenolateMofetil吗替麦考酚酯ACTHAdrenocorticotropicHormone促肾上腺皮质激素GMBglomerularbasementmembrane肾小球基底膜HEhematoxylin-eosin苏木精-伊红PASperiodicacid-schiff过碘酸雪夫PASMperiodicacid-silvermetheramine过碘酸六胺银IX 第1章引言第1章引言1.1背景及意义膜性肾病（membranousnephropathy，MN）的特征性病理表现是肾小球毛细血管袢基底膜上皮侧免疫复合物的沉积和基底膜的不规则增厚，是成人肾病综合征的常见病理类型，近年来发病率呈逐渐上升的趋势[1]。约25%MN继发于感染、自身免疫性疾病、药物或重金属、代谢性疾病、肿瘤等因素[2]，称为继发性膜性肾病（Seconderymembranousnephropathy,SMN）。若无明显继发性因素，则称为特发性膜性肾病（Idiopathicmembranousnephropathy,IMN）。近年来，MN的发生率呈上升趋势，环境因素及生活习惯对MN发病增加的影响逐渐得到人们的关注。吸烟是全球公共卫生领域所面临的重大问题，我国更是烟草大国，流行病学调查显示[3]，我国烟草使用目前基本处于历史高峰期，吸烟人群超3亿之多，且无明显的降低趋势，被动二手烟暴露情况无明显改善，更为棘手的是青年人群（15～24岁）吸烟率逐年上升。东北地区除男性吸烟率基本等同于全国其他地区外，还具有女性吸烟率较高的特点。吸烟对呼吸循环系统的损害性及其致癌性已被人们普遍知晓，近年国外多项研究显示，吸烟在肾脏疾病的发生及进展中同样起到不可忽视的危害作用。其中作为烟草最主要的有害成分之一，动物实验研究显示尼古丁可引起肾小球系膜增生、间质萎缩和小管上皮细胞的损伤以及小动脉壁增厚等病变[4-7]。此外吸烟可导致较高剂量重金属镉和铅的暴露，而镉和铅易在肾内蓄积并具有肾脏毒性[8][9]。不同的研究显示吸烟对不同肾脏疾病的损害存在差异性，目前国内外鲜有IMN患者吸烟状态及吸烟对IMN临床及病理影响方面的研究，遂本研究旨在调查IMN患者的吸烟状态，分析IMN患者吸烟状态与临床病理指标的关系，探讨吸烟对IMN的影响。既往研究发现IMN患者体内B淋巴细胞水平上调，且外周血B淋巴细胞水平的升高与IMN患者尿蛋白定量之间具有明显的相关性，肾组织中B细胞浸润聚集的数量和程度与正常人、局灶节段性肾小球硬化、微小病变性肾病等肾小球疾病患者相比要明显增多[10][11]，因此多数研究者认为B淋巴细胞功能异常1 第1章引言在IMN的发病过程中发挥着重要作用。B淋巴细胞被异常活化后，通过介导体液免疫、合成分泌抗体、与足细胞表面抗原结合形成上皮下的原位免疫复合物，然后活化补体致肾组织损伤，从而发生IMN，因此，目前普遍认为IMN是一种抗原抗体介导的自身免疫性疾病。B淋巴细胞活化因子（B-cellactivatingfactorbelongingtotumornecrosisfactorfamily，BAFF）是肿瘤坏死因子超家族中的一员，最早在1999年被发现，通过与B淋巴细胞表面的特异性受体结合，诱发B淋巴细胞增殖和分化，促进抗体的合成与分泌，它的过度表达可能促进自身反应性B淋巴细胞的形成，损害免疫耐受。近年越来越多的研究证实BAFF参与多种自身免疫性疾病的发生，在系统性红斑狼疮、干燥综合征以及IgA肾病等疾病患者体内的BAFF水平增高。在多项关于慢性阻塞性肺疾病等呼吸系统疾病的研究中发现：吸烟者及暴露于烟草烟雾的小鼠体内BAFF的表达水平升高，而高表达的BAFF在吸烟所诱导的自身抗体形成过程中发挥着十分重要的作用[12]。吸烟对IMN患者体内BAFFmRNA表达水平的影响以及IMN患者体内BAFFmRNA的表达是否异常，目前国内外尚无此类研究，遂本研究选取明确诊断为IMN的患者43例，其中吸烟者17例，非吸烟者26例，健康对照36例，以人外周血单个核细胞BAFFmRNA的表达水平为切入点采用Real-timePCR方法进行检测，旨在进一步揭示IMN的发病机制并为其诊治提供新思路。1.2IMN发病机制的研究进展膜性肾病其实是属于病理形态学诊断名词，是导致成人肾病综合征的常见病理类型，在确诊IMN之前必须除外感染、自身免疫性疾病、代谢性疾病、肿瘤、药物及重金属等继发性病因。研究已证实IMN是一种针对肾小球足细胞的膜表面自身抗原、抗原抗体免疫复合物形成、补体介导和参与的器官（肾脏）特异性自身免疫性疾病[13]。根据Ehrenreich-Churg分期标准进行分期：Ⅰ期肾小球病变轻微，毛细血管基底膜无明显增厚，大致正常，可见上皮细胞的足突融合；Ⅱ期基底膜弥漫性增厚，上皮细胞下沉积有多量大块的电子致密物，并可见基底膜呈钉突状改变；Ⅲ期基底膜高度增厚，增生的基底膜包裹电子致密物，钉突融合，部分电子致密物被吸收致基底膜呈虫蚀状；Ⅳ期基底膜明显不规则2 第1章引言增厚，大部分电子致密物被吸收而表现出与基底膜相近的密度。IMN好发于中老年男性，起病隐匿，临床表现多样，以水肿为首发症状者最常见，主要表现为肾病综合征，自然病程预后差异较大，虽有三分之一左右的患者可自行缓解，然而仍有30%-40%的患者疗效不佳，在5-15年内进展致终末期肾脏病[2]，因此学者们探索IMN发病机制的脚步从未停止。1.2.1Heymann肾炎模型早在1959年Heymann等通过给大鼠注射同种异体肾皮质提取物（主要为肾小管刷状缘成分FxlA）后发现可形成与人MN类似的病理变化以及临床症状，即主动型Heymann肾炎；将同种异体抗FxlA的抗体注射入大鼠体内可成功制造出Heymann肾炎模型，这一模型为被动型Heymann肾炎[14]，该模型揭示了疾病中的免疫复合物为原位免疫复合物沉积而非循环免疫复合物。Heymann肾炎模型中致病性抗原FxlA中的主要抗原成分为megalin，系一种分子大小为330kD的糖蛋白，主要分布在近曲小管，少量存在于足细胞的细胞器及足突表面，虽然Heymann肾炎模型的病理表现和临床表现与人MN相似，但在人膜性肾病患者的肾小球中并没有检出megalin抗原，且血清中也没有发现抗该抗原的抗体，故此模型不能完全用于解释人类IMN的发病机制。动物实验研究发现，用先天性缺乏补体的动物制造的Heymann肾炎模型，虽仍然存在有肾小球上皮下免疫复合物的沉积，但并没有明显蛋白尿的产生，说明补体在Heymann肾炎发病过程中是必需的，进一步选择性耗竭抗体证实了C5b-9在肾小球足细胞的损伤和蛋白尿的形成过程中发挥重要的作用，随后大量的研究表明在MN的发病过程中存在有补体调节的紊乱，导致补体被激活后形成膜攻击复合物C5b-9[15][16]，导致肾小球足细胞的损伤，如细胞骨架结构的改变，引起裂孔膜蛋白与细胞骨架蛋白的分离，损害裂孔膜的完整性，导致蛋白尿的产生[17]；基质金属蛋白酶9的表达增加，破坏毛细血管基底膜，同样参与蛋白尿的产生；此外，C5b-9可通过刺激活性氧产生增多，环氧化酶2的上调，磷脂酶A2的活化等多种途径损伤足细胞。1.2.2中性肽链内切酶2002年报道发现体内无中性肽链内切酶（neutralendopeptidase，NEP）的孕3 第1章引言妇，在怀有正常胎儿后体内循环中可产生针对中性肽链内切酶的抗体，第二次妊娠时该抗体可穿过胎盘屏障与胎儿肾脏足细胞表面的NEP相结合，形成肾小球基底膜上皮侧原位免疫复合物，致使新生儿肾病综合征的发生，显微镜检查可见与MN相同的病理表现，通过将抗NEP血清注射于家兔体内，病理观察可见基底膜上皮侧免疫复合物和C5b-9的形成，并且尿中出现蛋白，消除体内抗NEP抗体后，患儿病情可得到缓解[18]。此报道研究首次证实了人类MN与大鼠Heymann肾炎具有相似发病机制，虽然此种发病形式罕见，且新生儿MN占MN比例很少，但对IMN的发病机制的揭示提供了重要线索，研究者们认为除了megalin、NEP外，尚有其他足细胞抗原参与了膜性肾病的发生。1.2.3特发性膜性肾病患者体内淋巴细胞的变化目前认为IMN是一种抗原抗体介导的自身免疫性疾病，而在自身免疫性疾病的发病过程中，B淋巴细胞介导的体液免疫发挥着至关重要的作用。多项研究均显示在IMN患者体内的B淋巴细胞计数明显上调，病情缓解后此异常可以纠正[19]。使用能够抑制细胞增殖，诱导B淋巴细胞凋亡的抗B细胞表面抗原CD20的利妥昔单抗可以使IMN患者的蛋白尿得到缓解[20-21]。此外，有研究显示IMN患者肾间质可见B淋巴细胞聚集，且B淋巴细胞的聚集程度要明显高于正常人和其他肾小球疾病如局灶节段性肾小球硬化和微小病变性肾病[12][22]。免疫荧光检测IMN患者肾组织，沉积在基底膜上皮下的免疫复合物以IgG和补体C3为主，其中IgG以G4亚型为主，有研究证实，IMN患者体内的B淋巴细胞分泌IgG4亚型的能力显著增强[22]，因此，B淋巴细胞功能异常在特发性膜性肾病的发病中发挥重要的作用，使人们对IMN发病机制的研究进入了一个新的时代。1.2.4M型磷脂酶A2受体2009年M型磷脂酶A2受体(M-phospholipaseA2receptor，PLA2R)第一次被证实是成人IMN的相关靶抗原，他们在筛选入组的70％IMN患者体内检测到一种自身抗体，该抗体可以和一种分子量为185kD的蛋白成分相结合，通过质谱分析证实该蛋白成分为PLA2R，主要存在于肾小球足细胞表面，且IMN患者血循环中存在以lgG4亚型为主的抗PLA2R抗体，显微镜下观察可见PLA2R4 第1章引言和抗PLA2R抗体结合形成的免疫复合物在肾小球基底膜上皮侧沉积，而在入组的继发性膜性肾病、其他类型的肾小球疾病和健康对照者血清中没有检测到抗PLA2R抗体，这一重大发现在IMN发病机制的研究中具有里程碑式意义[23]。磷脂酶A2具有水解与甘油三酯耦联的脂肪酸酯的作用，在IMN中有主要作用的是分泌型（secretory-PLA2,sPLA2）[24-25]。根据PLA2R分布部位的不同可分为神经型受体（neuronal-type，N型）和肌肉型受体（muscle-type，M型），在人类肾脏主要表达于肾小球足细胞，且以为M型PLA2R为主[26]。M型PLA2R是一种Ⅰ型跨膜蛋白，属于C型外源性凝集素超家族-甘露糖受体家族成员，其结构包括三部分即：胞外段、跨膜区和C末端胞内段，它与分泌型磷脂酶A2结合对细胞增殖、趋化及炎症因子的释放等炎症反应过程进行调节[27]。Beck等仅在IMN患者体内发现抗PLA2R抗体的存在，而在SMN、非膜性肾病的肾小球疾病和正常人中未检测到，表明该抗体对IMN的诊断具有一定的特异性，越来越多的国内外研究资料支持这一观点，根据不同团队的报道，抗PLA2R抗体在IMN患者中的阳性率为52%-99.9%，其中中国人群为82%，特异性达90%以上[26][28-30]，这种阳性率的差异可能与患者入选标准或抗体检测方法不同有关。抗PLA2R抗体除了可以用来鉴别诊断IMN外，还可监测IMN的疾病活动性。Kangigicherla研究发现75%处于疾病活动的IMN患者抗PLA2R抗体阳性，在完全缓解的IMN患者中抗PLA2R抗体阳性率仅10%，观察随访发现抗PLA2R抗体的滴度与蛋白尿水平的升高或下降保持一致，且抗体的变化早于蛋白尿，所以认为抗PLA2R抗体的滴度与蛋白尿呈正相关[31]。Hoxha[26]等使用利妥昔单抗治疗IMN患者发现抗体转阴比蛋白尿完全缓解提前8周。SegarraMedrano[32]等使用他克莫司治疗IMN随访观察发现缓解组抗PLA2R抗体滴度明显下降且下降早于尿蛋白定量的减少。这些研究结果提示血清抗PLA2R抗体滴度可能成为监测IMN病情变化和治疗效果的一个良好指标，甚至比蛋白尿更为敏感，可能为临床方案的及时修改提供依据。另外，有研究发现抗PLA2R抗体还可用于评估IMN预后的预测指标，Kanigicherla[31]等观察IMN患者肾穿刺活检时抗PLA2R抗体滴度水平与随访90个月后病情发展情况的关系，发现未缓解组比缓解组基线抗PLA2R抗体滴度要高，回归分析显示基线PLA2R滴度是5年内肌酐升高的危险因子。Hofstra[33]等通过小样本研究发现，经免疫抑5 第1章引言制治疗后抗体转阴组比抗体仍然阳性组复发率低。但是抗PLA2R抗体能否作为一个良好指标来预测肾脏预后仍需大样本数据证实。综上，抗PLA2R抗体可协助及鉴别诊断IMN，并对疾病活动度的判断、治疗方案的制定和更改、疗效的评价、预后的估测等具有重要价值，但是有个别报道[28][34]发现在狼疮相关MN、乙肝相关MN及肿瘤相关MN中发现抗PLA2R抗体阳性，所以抗PLA2R抗体可否用于鉴别SMN尚存在争议，但有学者倾向于用二元论来解释这一现象。总之，PLA2R抗体是目前唯一公认且可用于临床检验的的IMN生物标志物。1.2.5醛糖还原酶和超氧化物歧化酶-2抗体2010年Prunotto等[35]在IMN患者血清和肾组织中发现了抗醛糖还原酶(aldosereductase，AR)与锰超氧化物歧化酶-2(manganesesuperoxidedismutase-2，SOD2)抗体，同样以IgG4为主，透射电镜观察可见AR、SOD2分别和它们的抗体特异性结合，并且与补体形成的膜攻击复合物共定位于肾小球足细胞上皮下的免疫复合物中，而在其他肾小球疾病和正常人体内均未检测到。Murtas等研究显示，在IMN患者中抗AR-IgG4的阳性率为34％，抗SOD2-IgG4抗体的阳性率为28％，正常情况下醛糖还原酶和超氧化物歧化酶-2只在肾小管上皮细胞表达，病理状态下，可在肾小球表达，因此他们认为AR和SOD2可能并不是IMN的原始靶抗原[36]。1.2.6α-烯醇化酶2011年，Bruschi等人[37]在部分IMN肾小球基底膜上皮下发现α-烯醇化酶与相应的IgG4抗体、C5b-9共同存在于沉积的电子致密物中，在这些患者的血清中同时存在相应的IgG4抗体。1.2.7阳离子化牛血清白蛋白2011年，Debiec等对50例IMN患者和172名健康人的血清进行检测，在11例IMN患者中发现高水平的牛血清白蛋白(cationicbovineserumalbumin，BSA)及其lgGl和lgG4亚型抗体，这些患者体内牛血清白蛋白的来源为食源性，作者认为由于儿童肠道尚未发育成熟，牛奶中的牛血清白蛋白可能以某种形式6 第1章引言通过肠道屏障及阳离子化，经过血液循环吸附于富含负电荷的肾小球滤过膜，抗BSA抗体与吸附的BSA结合形成原位免疫复合物，进而激活补体损伤肾组织[38]。该发现提示外源性种植性抗原可能参与部分IMN的发病过程。1.2.8THSD7A抗体自2009年发现PLA2R及抗PLA2R抗体以来，引发了研究的热潮，多项研究显示IMN患者体内抗PLA2R抗体阳性率多为70-80%，另存在20%-30%无明显激发因素的IMN患者体内未检测到抗PLA2R抗体，提示可能存在其他内源性抗原参与其发病机制，2014年Tomas等首先提出Ⅰ型血小板反应7A域（Thrombospondintype-1domain-containing7A,THSD7A）可能是IMN的第二个靶抗原。早期对THSD7A的研究主要集中在骨质疏松和肿瘤相关性血管疾病的靶点治疗等方面，尽管也曾在肾组织中检测到THSD7A的存在，但未引起研究者们的注意。2014年，Tomas等研究发现抗PLA2R抗体阴性的IMN患者的血清标本可与一种肾小球蛋白成分特异性结合，该蛋白成分分子量大小为250Kd，而在抗PLA2R抗体阳性特发性膜性肾病、其它肾小球疾病患者及健康对照组的血清标本中均不能识别这一蛋白成分，通过免疫印迹、免疫组化、质谱分析等多种方法确定这一250Kd的抗原分子为THSD7A，同时在血清中发现抗THSD7A的特异性抗体，同样是以lgG4亚型为主，由此认为THSD7A是参与IMN发病的另一个靶抗原[39]。THSD7A在人肾组织主要表达于足细胞膜表面，系一种跨膜蛋白，由胞外部分、跨膜域和胞内部分组成，其胞外段富含二硫键及N-糖基化区域。Lwakura[40]等人研究日本人群中IMN患者THSD7A肾小球阳性染色率为9.1%，中国小样本研究[41]IMN患者THSD7A肾小球阳性染色率为2.3%，目前有关IMN与THSD7A的研究较少，尚待更多大样本深入研究，这一发现是IMN病理机制的研究的重大突破，对抗PLA2R抗体阴性的IMN患者的诊治具有重要意义。数十年来对IMN发病机制的研究从未停止，从Heymann肾炎模型的成功建立到NEP的发现，以及随后的PLA2R、醛糖还原酶、超氧化物歧化酶、α-烯醇化酶、牛血清白蛋白及THSD7A的发现，一次又一次掀起了IMN发病机7 第1章引言制研究的浪潮，尽管IMN发病的具体机制尚未完全明确，但目前我们已基本证实，IMN致病抗原多定位于足细胞表面，抗原抗体反应和补体激活是导致其组织受损的重要环节，相信随着研究的不断深入，IMN的发病机制将会被逐步揭示。1.3IMN治疗进展IMN好发于中老年男性，不但临床表现轻重不一，预后也有较大差异，约1/3的患者临床表现可自发缓解，约1/3患者存在持续的蛋白尿但是肾功能较稳定，剩余患者数年后可进展至终末期肾衰竭[42]。部分早期IMN患者经糖皮质激素及细胞毒药物治疗后可达临床缓解，但缓解后易复发，且随着疾病的进展，疗效渐差，晚期IMN患者治疗上往往难以达到治疗缓解，鉴于免疫抑制治疗的不良反应以及有部分患者可自发缓解，所以对于IMN患者的治疗时机、初次治疗方案以及复发后治疗方案的选择尤为重要，目前治疗IMN的方法主要包括保守治疗、激素和（或）免疫抑制治疗、中药治疗。1.3.1保守治疗主要包括注意休息，调控饮食，减少尿蛋白，降低血脂及预防血栓栓塞并发症等治疗。IMN最多见的临床表现是肾病综合征，大多数患者有持续的蛋白尿，而蛋白尿是肾组织损害和肾功能衰减的重要危险因素，因此对于有蛋白尿的IMN患者，降低其尿蛋白水平是治疗的关键环节。血管紧张素转化酶抑制剂（AngiotensinConvertingEnzymeInhibitors,ACEI）和（或）血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂（AngiotensinⅡReceptorBlocker,ARB）类药物除可降低血压外，已被证实具有降低尿蛋白水平及保护肾脏功能的作用，此类药物在用于蛋白尿的治疗时，需要适量多于常规降压剂量。试验证实ACEI能延缓肾衰竭进展速度，并显示出ACEI对于24h尿蛋白定量较多的患者疗效更佳，ACEI类药物在减少尿蛋白方面相对快于ARB[43]。对于ACEI及ARB在临床中是否可以联合应用目前存在争议，但有研究显示两者联用后肾功能恶化和血钾升高的风险均会增加一倍以上[44]，所以强调个体化应用，并注意监测血肌酐和钾离子的水平。对于水肿明显，限盐限水后仍不能消肿者可适当利尿治疗，对8 第1章引言血清白蛋白水平显著降低、重度水肿、尿量减少的肾病综合征患者，可考虑输注血浆或人血白蛋白后利尿，但应注意避免过频过多。MN患者血栓栓塞并发症的发生率要明显多于其余病理类型，KDIGO指南[45]建议以肾病综合征为临床表现的IMN患者，若有显著的血清白蛋白减少（小于25g/L），并有以下血栓形成的风险时：尿蛋白定量大于10g/d、身体质量指数超过35kg/m2、既往有血栓栓塞的病史、有血栓栓塞家族遗传史、NYHAⅢ-Ⅳ级的充血性心衰、近期行腹部或矫形手术、需长时间制动，被认为需预防性的口服华法林治疗，在使用华法林治疗前需先使用短期足够剂量的肝素治疗，以使凝血时间延长。如果存在肾功能受损，肝素的剂量需要被调整。这种预防血栓栓塞并发症治疗的具体疗程尚无明确界定，但只要患者血清白蛋白水平低于30g/l，预防性抗凝治疗即可继续使用。1.3.2激素和（或）免疫抑制治疗目前得到大家公认的是IMN单用激素治疗无效，需与免疫抑制剂联合使用，某些免疫抑制剂可单独使用。对于成人IMN何时需开始免疫抑制治疗，KDIGO指南指出：在以肾病综合征为临床表现的IMN患者，具备以下几点中至少一点的患者可开始免疫抑制治疗：①经过不少于6个月的控制血压及降尿蛋白治疗后，尿蛋白定量仍持续大于4g，并且保持在基线水平的50%以上，无下降趋势者。②存在与肾病综合征有关的严重的，致残的或威胁生命的临床症状者；③确诊后6-12个月内SCr水平升高30%或以上，eGFR不小于20-30ml/（min·1.73mm2)者，但这种改变不是并发症所致。但是对于SCr持续大于3.5mg/dl（309umol/L)(或eGFR小于30ml/（min·1.73mm2)及超声下肾脏体积缩小者（长度小于8cm），或伴随有严重的或潜在威胁生命的感染患者不建议使用免疫抑制治疗。常用的免疫抑制治疗包括烷化剂、钙调神经磷酸酶抑制剂、吗替麦考酚酯。治疗IMN常用的烷化剂包括环磷酰胺和苯丁酸氮芥，基于多项研究，KDIGO指南将Ponticelli方案即周期性糖皮质激素/烷化剂治疗推荐为IMN初始治疗的方案之一，中国成人肾病综合征免疫抑制治疗专家共识指出根据我国患者情况，建议使用激素+静脉注射/口服环磷酰胺方案，环磷酰胺剂量为9 第1章引言200mg，隔日一次，累及剂量为6-8g。多项研究表明[46-47]环磷酰胺+激素的缓解率相似或优于苯丁酸氮芥+激素治疗，且致使治疗中断的严重不良反应的发生率苯丁酸氮芥组更高，基于安全性及副作用的角度，目前无论是KDIGO指南还是国内的专家共识，均建议初次治疗时选用环磷酰胺而不是苯丁酸氮芥。2010年通过小样本对照研究比较早期和延迟使用糖皮质激素+环磷酰胺治疗，结果显示两组之间的缓解率和复发率相似，并且随访两组的蛋白尿及肾功能没有明显差异，此研究结果表明，适当推迟免疫抑制治疗的时间是可行的，尤其是对预后为自发缓解的患者收益更大，可避免不必要的免疫抑制治疗，但延迟治疗可能导致较多的副作用，更高的住院率及更长的住院时间[48]。所以我们在临床工作中，需要对IMN患者进行适合的治疗方案和时机进行个体化选择，争取以最小风险获得最大收益。钙调神经磷酸酶抑制剂：主要包括他克莫司和环孢素两种，在治疗过程中需密切检测血药浓度，浓度过低达不到疗效，浓度过高可能导致严重的不良反应。多项研究表明，环孢素+小剂量激素在治疗特发性膜性肾病时的缓解率要高于烷化剂，且不良反应较少，但复发率较高。前瞻性研究显示[49]，环孢素联合激素治疗IMN的缓解率随着时间的延长是升高的，且长期小剂量环孢素和低剂量激素联合维持治疗可减少复发，但需注意的是，环孢素的长期应用可能增加肾小管萎缩、肾间质纤维化和肾小动脉硬化的风险，所以在开始治疗前已经有肾功能损害或肾活检提示肾小管间质病变明显者，需慎用此药物。他克莫司具有强大的免疫抑制作用，约是环孢素的数十倍，且与环孢素相比具有肝毒性较小的优势，2010年国内一项针对IMN患者小样本随机对照研究，他克莫司+激素治疗组39例和环磷酰胺+激素治疗组34例均进行为期半年的治疗，评价疗效得出他克莫司组的缓解率要明显高于环磷酰胺组，但1年后随访发现，两组的缓解率无明显差异，该结果提示他克莫司联合激素治疗可能在短期疗效上优于环磷酰胺联合激素治疗[50]。国外的一项研究结果与之相似。但是一项针对56例IMN患者治疗的研究发现，他克莫司联合泼尼松组与环磷酰胺联合泼尼松组比较，在进行为期1年的治疗以后，前者的治疗缓解率要优于后者[51]。国内共识及KDIGO指南均推荐糖皮质激素+钙调神经磷酸酶抑制剂为IMN的初始治疗方案之一，但两个指南在治疗方案的具体内10 第1章引言容上存在一定差异，中国的专家共识建议起始剂量为：他克莫司0.05-0.10mg·Kg-1·d-1、环孢素3.0mg·Kg-1·d-1，分两次口服，12h一次；联合小剂量激素（泼尼松0.4-0.5mg·Kg-1·d-1）。KDIGO指南建议环孢素：3.5–5.0mg·Kg-1·d-1，分两次口服，每12小时一次，同时使用泼尼松0.15mg·Kg-1·d-1，连用6个月；他克莫司：0.05–0.075mg·Kg-1·d-1，分两次口服，每12小时一次，不联合使用泼尼松，使用6-12个月。两个指南均建议从最低推荐剂量起始，然后逐渐增加剂量，避免急性肾毒性的发生，药物谷浓度均推荐他克莫司（5-10ng/ml），环孢素（100-150ng/ml），推荐至少经过6个月的钙调神经磷酸酶抑制剂+激素治疗，若正规治疗6个月后无缓解，则建议停止使用，若达到缓解且没有明显肾脏毒性时，推荐每4-8周逐渐减量，直至初始剂量的一半，至少维持治疗12个月。尽管目前CNI联合激素治疗IMN的疗效肯定，但缺乏长期多中心大样本的研究去进一步阐明其长期疗效、安全性等问题。吗替麦考酚酯（MycophenolateMofetil,MMF）：早期被用于器官移植抗排斥的治疗，之后逐渐被应用于自身免疫性疾病的治疗，近年来尝试被应用于肾小球疾病的治疗，但具体疗效尚存在争议，尽管已有较多研究显示吗替麦考酚酯对IMN有治疗作用，但亦有研究显示吗替麦考酚酯在治疗IMN的过程中没有表现出明显的优势，且复发率较高。我国一项纳入20例初诊IMN患者的随机对照研究表明，MMF联合激素治疗组与Ponticelli方案治疗组随访15个月观察，两组缓解率无明显差异[52]。有研究对比MMF联合激素治疗与口服环磷酰胺联合激素治疗发现，早期缓解率两组相似，但在后期MMF联合激素治疗组复发率更高[53]。同样荟萃分析结果显示吗替麦考酚酯治疗IMN时没有表现出明显优势，甚至缓解率低于对照组，但可降低白细胞减少症的发生。关于MMF在IMN治疗中的确切疗效尚需要进一步研究，目前普遍认为不推荐MMF作为治疗特发性膜性肾病的首选。1.3.3利妥昔单抗随着人们对IMN发病机制的探索，抗PLA2R抗体、THSD7A抗体相继被发现，B淋巴细胞异常活化导致自身免疫耐受破坏在IMN发病过程中的作11 第1章引言用逐渐得到公认，与B细胞表面CD20特异性结合的利妥昔单抗开始被应用于IMN的治疗中，由于只有B细胞表面表达CD20，所以利妥昔单抗没有烷化剂、CNI那样广泛的免疫抑制作用，所以具有安全性高、副作用小的特点。早在2003年，利妥昔单抗就被应用于特发性膜性肾病的治疗，对8例保守治疗6个月无缓解的IMN患者给予利妥昔单抗4周后，尿蛋白定量即出现显著的下降，随访1年所有患者肾功能稳定，其中2例达到完全缓解，3例部分缓解，剩余患者尿蛋白水平均不同程度的明显下降，且未见明显不良反应[54]。之后的多项研究结果显示，对于激素联合免疫抑制剂治疗无效、激素依赖或疗效不好的IMN患者，使用利妥昔单抗治疗后可获得良好的缓解率和效果，但目前研究均为小样本，缺乏大样本前瞻性对照研究，所以关于关于利妥昔单抗在IMN治疗中的疗效及安全性尚需进一步明确和评估。1.3.4促肾上腺皮质激素早在几十年前就应用于肾病综合征的治疗，降脂的同时可减少尿蛋白水平，但由于新兴药物的不断发现，关于促肾上腺皮质激素（AdrenocorticotropicHormone,ACTH）在IMN治疗中的作用一直未得到进一步深入研究，近年来的研究表明，ACTH在IMN中的治疗效果不容乐观，接受ACTH治疗组与激素联合环磷酰胺治疗组的缓解率相似[55]。而一项前瞻性研究结果显示ACTH治疗IMN的缓解率远低于环磷酰胺[56]。目前ACTH减少尿蛋白的作用机制尚未完全明确，且ACTH用于治疗IMN的经验较少，需要更多长期大样本的研究。KDIGO指南提出IMN复发时可考虑尝试使用ACTH。1.3.5中药治疗作为祖国医学，我国在此方面积累了一定的经验，尤其是对雷公藤的研究较为深入。动物试验表明[57]雷公藤可减少上皮侧的电子复合物，包括膜攻击复合物C5b-9，具有保护足细胞的作用，对IMN患者的前瞻性研究显示小剂量激素联合雷公藤可获得较满意的缓解率，与环磷酰胺联合激素治疗相比，可获得较早的缓解，但短期的复发率较高。但较局限的是目前的研究均是以我国患者为研究对象，其推广使用尚需要长期多区域大样本的深入研究。综上，目前针对IMN的治疗尚处于研究阶段，随着自身抗体的不断被发12 第1章引言现，发病机制的研究取得重大进展，相信不久的将来特异性高的，副作用小的靶向治疗将逐步被发现。13 第2章资料和方法第2章资料和方法2.1研究对象及标本收集纳入2014年01月01日~2017年03月31日我院肾病内科收治的经肾穿刺活检病理明确诊断为典型IMN患者318例，以上患者均已排除自身免疫性疾病、代谢性疾病、病毒性肝炎、肿瘤等导致继发性膜性肾病的病因，所有入选患者均有完善的临床及病理资料记载。因RNA的提取需使用新鲜血液，因此我们收集2016年09月至2017年03月经肾穿刺活检病理明确的成人IMN患者43例患者的早晨空腹静脉血，其中男性28例，女性15例，年龄24～68岁，平均年龄（50.13±9.89）岁，所有患者均为初次诊断，未接受过激素及免疫抑制治疗。43例IMN患者中吸烟者17例，非吸烟者26例，吸烟组平均年龄为（52.47±9.77）岁，非吸烟组平均年龄为（48.14±11.15）岁，两组在年龄上差异无统计学意义（P＞0.05）。35例健康对照为我院职工及健康体检者，同样采集早晨空腹静脉血，其中男性22例，女性13例，年龄23～61岁，平均年龄（47.03±9.13）岁，与IMN组在性别，年龄上相匹配，差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究受试者均知情同意。2.2主要试剂及器材（1）Trizol碧云天生物技术研究所（2）引物合成上海生工生物工程有限公司（3）人外周血单个核细胞分离液天津市灏洋生物制品有限公司（4）细胞洗涤液天津市灏洋生物制品有限公司（5）BestarTMqPCRMastermix(SYBRGreen)德国DBI®Bioscience（6）PrimeScriptTMRTReagentKit日本TAKARA（8）冷冻型高速离心机德国eppendorf（9）TpersonalPCR仪德国Biometra（10）7300RealTimePCRSystem美国AppliedBiosystems14 第2章资料和方法2.3实验步骤2.3.1临床资料患者的性别、年龄、职业、住址等一般资料于入院时收集，24小时尿蛋白定量由我科肾病研究室检测，尿常规、血常规、血白蛋白、血糖、血脂、血尿酸、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、肾功能、ANA谱、肿瘤标志物等实验室检查由我院检验科检测。结合上述检测指标，采用简化的MDRD公式计算eGFR（ml·min-1·1.73m-2）。2.3.2病理资料所有入选患者肾组织标本均进行光镜、免疫荧光和电子显微镜检查。（1）光镜资料：所有标本均具有10个以上的肾小球数量，分别进行固定、石蜡浸透和包埋，薄切片（2-3um），然后行HE或苏木精-伊红染色、PAS或过碘酸雪夫染色、PASM或六胺银染色、Massontrichromestain或马松三色染色，年龄超过40岁者行刚果红等染色。（2）免疫荧光：采用冰冻切片直接免疫荧光法确定标本中有无相应的抗原或免疫复合物的存在以及它们的分布特点，免疫复合物的量根据荧光强度进行判读。常规进行IgA、IgG（IgG1、IgG2、IgG3、IgG4）、IgM、C3、C4、C1q、Fib的检测。（3）电镜：采用透射电镜进行超微结构的观察，如电子致密物沉积的部位和程度，以便进一步明确诊断、鉴别诊断及病理分期。2.3.3诊断及调查评分标准（1）肾病综合征（nephroticsyndrome，NS）诊断标准：①尿蛋白＞3.5g/d；②血浆白蛋白＜30g/L；③水肿；④血脂升高。①②两项为诊断所必需。（2）IMN病理诊断分期参考Ehrenreich-Churg的标准：Ⅰ期基底膜基本正常，无明显增厚，可见小而分散的电子致密物沿基底膜上皮侧不规则分布，可见足突广泛融合；Ⅱ期基底膜弥漫增厚，上皮下有多量大块的电子致密物沉积，并可见基底膜呈钉突状改变；Ⅲ期基底膜呈高度增厚，钉突融合，电子致密物被增生的基底膜包绕，部分电子致密物被吸收而变得不规则和稀疏，呈虫蚀状15 第2章资料和方法或链环状表现；Ⅳ期基底膜明显增厚且不规则，钉突消失，大部分电子致密物被吸收而表现为与基底膜的密度相近。（3）吸烟状态的具体定义参考美国疾病控制和预防中心标准：①.吸烟者：累计吸烟达到100支者为吸烟者。②.目前吸烟者：符合吸烟者条件，调查前30天内至少有一天仍在吸烟。③.戒烟者：符合吸烟者条件，调查时已停止吸烟30天以上者。（4）肾间质和血管的病理半定量评分方法参考Katafuchi的标准：肾小管间质积分为0-9分：包括肾间质炎细胞浸润（0-3）、肾间质纤维化（0-3）、肾小管萎缩（0-3），其中0分表示正常、1分表示病变累及面积＜25%、2分表示病变累及面积为25%～50%、3分表示病变累及面积＞50%。血管病变积分包括血管壁增厚积分和血管玻璃样变性积分，血管壁增厚定义为横切面下血管内径/外径＜0.5，血管壁增厚积分评分标准为：0分表示正常、1分表示病变血管＜10%、2分表示病变血管为10%～25%、3分表示病变血管＞25%，血管玻璃样变性积分同血管壁增厚。肾间质血管总分等于肾小管间质积分与血管病变积分之和。2.3.4人外周血单个核细胞（PBMC）的分离（1）使用移液枪缓慢将3ml分离液加入15ml的离心管中。（2）使用吸管缓慢将血液样本加于分离液之上，配平，400-650g离心20-30分钟（根据血液样本量调整离心条件，血液样本量越多，离心力越大，离心时间越长）。（3）离心后，可见离心管中标本共分四层。（4）小心缓慢吸取环状乳白色淋巴细胞层至另一15ml离心管中，加入10ml清洗液小心混匀。（5）250g，离心10分钟。（6）弃上清。（7）用吸管以5ml清洗液重悬所得细胞，250g离心10分钟。（8）重复6、7，弃上清得细胞沉淀。16 第2章资料和方法2.3.5Trizol一步法提取总RNA（1）向分离的PMBC沉淀中加入1mlTriol，反复吹打至细胞完全裂解，室温放置5min。（2）加入0.2ml氯仿，用力摇晃15-20s，室温放置15分钟。（3）4℃，12000g离心15分钟。离心后，混合物分离为三层，RNA存在于上层的无色水相。（4）小心取上层水相400ul转移至新的EP管中，加入0.5ml异丙醇混匀，室温放置20分钟。（5）4℃，12000g离心10分钟，可见管底附着少许白色胶状物。（6）弃上清，加入75%乙醇1ml，洗涤沉淀，4℃，7500g离心5分钟。（7）重复第6步2次。（8）弃上清后，室温晾干5-10分钟。（9）加入10ulDEPC水溶解RNA。（10）用核酸蛋白检测仪测定样品在260nm和280nm的吸收值确定RNA的纯度和浓度。2.3.6逆转录成cDNA（1）按照如下方案建立20ul反应体系Mixture：7ul（5×PrimeScriptBuffer：PrimeScriptRTEnzymeMixI：OligodTPrimer：Random6mers=4:1:1:1）RNA体积：1000/RNA浓度DEPC水：To20ul先加MIX，后加RNA（2）放入逆转录仪中，选择程序1、37℃15min2、85℃5s3、4℃2.3.7实时荧光定量检测PBMC中BAFFmRNA表达（1）BAFF引物由生工生物（上海）有限公司合成，引物序列如下：17 第2章资料和方法上游：ggagaaggcaactccagtcagaac下游：caattcatccccaaagacatggac24bp人ACTB内参引物由生工生物（上海）有限公司提供（2）将逆转录的cDNA稀释10倍SYBRGreen：10ul上游引物：0.5ul下游引物：0.5ul建立荧光定量20ul反应体系ROX：0.4ul10×cDNA：2ulDEPC水：6.6ul每个样品做3个复孔，加样完毕封盖标记，设置如下反应条件：（3）获得溶解曲线、扩增曲线、CT值，每份标本均复管检测，取其均值用作-△△CT计算基因表达水平，根据公式2计算各组基因相对于β-actin的表达量。2.4统计学分析—应用SPSS22.0行统计学分析，计量资料以X±S表示，计数资料应用例数（n）和百分比（%）进行表示，组间比较采用独立样本t检验、秩和检验、卡方检验，单因素相关性分析采用Pearson或Spearman相关分析，多因素分析采用多重回归法。以P<0.05为差异有统计学意义。18 第3章结果第3章结果3.1一般资料2014年01月01日~2017年03月31日我院行肾穿刺活检病理明确诊断为IMN患者318例，其中男性202例（63.5%），女性116例（36.5%），男：女=1.74：1，与我中心2010年01月-2014年12月关于IMN统计资料相比，女性所占比例（28.2%）有所升高，差异有统计学意义（P<0.05）。城乡比为0.64：1。具体见图3.1。发病年龄分布在17～84岁，平均年龄为50.97±12.99岁,按年龄分：少年儿童＜18岁，18岁≤青年＜45岁，45岁≤中年＜60岁，老年≥60岁，其中少年儿童组1例（0.31%）、青年组86例（27.04%），中年组141（43.34%）例、老年组90（28.31%）例。图3.1IMN性别、城乡分布图3.2特发性膜性肾病患者吸烟现状在318例IMN患者中吸烟者83例，占26.1%，吸烟者吸烟年限在5年～40余年，除满足美国疾病控制和预防中心标准外，均符合中国吸烟与健康协会标准（即连续或累积吸烟6个月及以上），其中男性72例，女性11例。非吸烟者235例，其中男性122例，女性113例，男性吸烟率为37.1%，显著高于女性8.9%，差异有统计学意义（P<0.01）。吸烟者发病年龄分布在32～76岁，平均年龄为51.87±10.09岁，按年龄分：少年儿童＜18岁，18岁≤青年＜45岁，19 第3章结果45岁≤中年＜60岁，老年≥60岁，其中青年组吸烟率为20%，中年组吸烟率为30.8%，老年组吸烟率为25%，各年龄段吸烟率之间差异无统计学意义（P＞0.05）。318例IMN受访者中目前吸烟者61例，占19.2%，其中男性52例，女性9例，男性目前吸烟率为26.8%，女性目前吸烟率为7.3%，差异有统计学意义（P<0.01）。83例吸烟者中戒烟者22例（26.5%），其中男性20例，女性2例，男性戒烟率（27.8%）与女性戒烟率（18.2%）之间差异无统计学意义（P＞0.05）。戒烟者全部为中老年，年龄分布在47～63岁。本次调查中，我们对61例目前吸烟者进行电话回访，其中失访7例，在54例有效回访者中，14例戒烟，32例表示吸烟量较患病前减少，8例吸烟量较前无改变。54例回访者均表示知晓吸烟有害健康，但吸烟对肾脏损害知晓者仅11例，46例受访者表示患病是其戒烟或吸烟量减少的主要原因。3.3吸烟和非吸烟IMN患者临床资料分析吸烟组与非吸烟组相比较，血红蛋白、血尿素氮、血肌酐、血尿酸水平均较高，差异具有统计学意义（P<0.05）；吸烟组与非吸烟组相比，eGFR水平较低，差异具有统计学意义（P<0.05）。年龄、血糖、血清白蛋白、血总胆固醇、血甘油三酯、血低密度脂蛋白、血高密度脂蛋白、24h尿蛋白定量水平在两组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。具体见表3.1。由于吸烟组与非吸烟组在性别百分比上差异有统计学意义，即吸烟组男性比例明显高于非吸烟组，由于男性血尿素氮、血肌酐、血尿酸、血红蛋白基础水平要高于女性，考虑性别差异对血尿素氮、血肌酐、血尿酸及血红蛋白水平的影响，进一步将吸烟组男性与非吸烟组男性进行对比，结果显示尽管吸烟组男性血红蛋白、血尿素氮、血肌酐及血尿酸水平均较非吸烟组男性高，但差异均无统计学意义（P＞0.05）。具体见表3.2。20 第3章结果表3.1吸烟组与非吸烟组IMN患者临床资料分析吸烟组非吸烟组年龄（岁）51.87±10.0949.35±13.61*男（%）72（86.7）122（51.9）24h尿蛋白定量（g）6.37±4.015.74±3.56血糖（mmol/L）5.28±0.845.38±0.6*血红蛋白（g/L）149±23.52138.31±21.44血清白蛋白（g/L）24.97±6.5725.98±6.13*血尿素氮（mmol/L）5.47±2.114.64±1.88*血肌酐（umol/L）87.53±20.5474.21±16.61*血尿酸（umol/L）357.48±70.69318.16±89.93血总胆固醇（mmol/L）8.77±2.758.41±2.4血甘油三酯（mmol/L）3.53±3.293.1±2.38血低密度脂蛋白（mmol/L）4.4±1.634.63±1.88血高密度脂蛋白（mmol/L）1.48±0.631.54±0.57-1-2*eGFR（ml·min·1.73m）73.13±16.1981.24±23.62注：与吸烟组相比，*P<0.05表3.2男性吸烟组与男性非吸烟组IMN患者临床指标分析吸烟组非吸烟组年龄（岁）53.12±9.7949.05±13.89血红蛋白（g/L）153.05±22.2148.94±20.77血尿素氮（mmol/L）5.57±2.195.01±1.82血肌酐（umol/L）90.07±20.7884.25±12.73血尿酸（umol/L）366.62±62.18360.9±84.24-1-2*eGFR（ml·min·1.73m）73.68±17.2583.23±19.93注：与吸烟组相比，*P<0.0521 第3章结果3.4吸烟和非吸烟IMN患者病理资料分析入选的318例IMN患者中，Ⅰ期膜性肾病者99例（占31.1%），Ⅱ期膜性肾病者202例（占63.5%），Ⅲ期膜性肾病者17例（占5.3%），无Ⅳ期膜性肾病者。83例吸烟者中Ⅰ期膜性肾病者27例（占32.5%），Ⅱ期膜性肾病者50例（占60.2%），Ⅲ期膜性肾病者6例（占7.2%）。135例非吸烟者中Ⅰ期膜性肾病者42例（占31.1%），Ⅱ期膜性肾病者87例（占64.4%），Ⅲ期膜性肾病者6例（占4.4%）。吸烟组与非吸烟组相比，各病理分期所占百分比差异无统计学意义。Ⅰ期膜性肾病者吸烟率为27.3%，Ⅱ期膜性肾病者吸烟率为24.8%，Ⅲ期膜性肾病者吸烟率为35.3%。各病理分期间吸烟率差异无统计学意义。具体见图3.2。图3.2吸烟组和非吸烟组各病理分期百分比以及各病理分期吸烟率分布图吸烟组与非吸烟组相比较，肾间质血管总分、肾小管萎缩、血管壁增厚方面差异有统计学意义（P<0.05）。吸烟组肾间质纤维化、肾间质炎细胞浸润、血管玻璃样变评分均较非吸烟组高，但差异无统计学意义（P＞0.05）。具体见表3.3和图3.3。22 第3章结果表3.3吸烟组与非吸烟组IMN患者肾脏病理指标分析吸烟组非吸烟组*肾间质血管总分4.0±1.663.12±1.78*肾小管萎缩0.97±0.190.81±0.42肾间质纤维化0.9±0.560.78±0.57肾间质炎细胞浸润0.86±0.580.81±0.55*血管壁增厚0.79±0.410.56±0.5血管玻璃样变0.38±0.290.29±0.2注：与吸烟组相比，*P<0.05图3.3吸烟组与非吸烟组IMN患者肾脏病理指标比较3.5IMN患者eGFR的单因素相关性分析为研究IMN患者eGFR相关因素，根据既往有关影响IMN进展危险因素的研究结论，我们分析了年龄、性别、收缩压、舒张压、24h尿蛋白定量、病理分期、间质血管评分等因素与eGFR的相关性，同时分析了吸烟与eGFR的相关性，结果显示eGFR与年龄、24h尿蛋白定量、收缩压呈负相关，与吸烟无明显相关。具体见表3.4。23 第3章结果表3.4IMN患者eGFR相关因素分析eGFRrP**年龄-0.471＜0.01性别0.1760.060舒张压-0.0930.321*收缩压-0.2040.028病理分期-0.0550.559*24h尿蛋白定量-0.2840.002间质血管评分-0.1480.116吸烟0.1640.079注：*P<0.05，**P<0.013.6IMN患者肾间质血管病变的单因素相关性分析为研究IMN患者肾间质血管病变的相关因素，根据既往有关影响肾小球疾病间质血管病变的研究以及专著[58-59]，我们分析了年龄、性别、吸烟、收缩压、舒张压、24h尿蛋白定量、尿酸等因素，结果显示间质血管总分与吸烟、年龄、收缩压、舒张压呈正相关。具体见表3.5。表3.5IMN患者肾间质血管损伤的相关因素分析间质血管总分rP**年龄0.375＜0.01性别-0.0240.801*吸烟0.2300.014*收缩压0.2240.016*舒张压0.2440.00924h尿蛋白定量0.1230.193尿酸0.1490.116注：*P<0.05，**P<0.0124 第3章结果3.7与IMN患者eGFR相关因素的多重回归分析进一步对单因素相关分析中与eGFR存在相关性的年龄、收缩压、24h尿蛋白定量进行多因素回归分析，发现eGFR与年龄、24h尿蛋白定量呈负相关。具体见表3.6。表3.6IMN患者eGFR相关因素的多重回归分析非标准化系数标准系数tSigβ标准误差试用版常量126.2737.52716.776＜0.01年龄-0.7740.140-0.447-5.517＜0.0124h尿蛋白定量-1.4390.489-0.239-2.9460.0043.8与IMN患者肾间质血管病变相关因素的多重回归分析进一步对单因素相关分析中存在相关性的年龄、吸烟、收缩压、舒张压进行多因素回归分析，其中自变量性别、吸烟进行哑元化处理，发现间质血管总分与年龄、吸烟呈正相关。具体见表3.7。表3.7IMN患者肾间质血管病变相关因素的多重回归分析非标准化系数标准系数tSigβ标准误差试用版常量2.2400.9072.4690.015年龄0.0490.0120.3494.021＜0.01吸烟0.7570.3510.1882.1610.0333.9Real-timePCR法检测β-antin及BAFFmRNA结果溶解曲线波形陡直，呈单峰状，说明扩增产物具有良好的特异性。具体见图3.4，图3.5，图3.6，图3.7。25 第3章结果图3.4内参基因β-antin扩增曲线对数图图3.5内参基因β-antin溶解曲线图图3.6BAFFmRNA扩增曲线对数图26 第3章结果图3.7BAFFmRNA溶解曲线图3.10吸烟组和非吸烟组IMN患者中BAFFmRNA表达吸烟组PBMCs中BAFFmRNA表达水平（2.54±0.90）与非吸烟（2.21±0.95）相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。3.11IMN组和正常对照组中BAFFmRNA表达IMN组PBMCs中BAFFmRNA表达水平（2.37±0.98）显著高于健康对照（1.75±0.48），（P<0.01）。具体见图3.8。图3.8IMN组与对照组BAFFmRNA表达水平比较3.12BAFFmRNA的表达与24h尿蛋白定量的关系经Spearman相关分析显示：IMN患者体内BAFFmRNA表达水平与24h尿蛋白定量之间呈正相关（r=0.61，P<0.01）。27 第4章讨论第4章讨论IMN是成人肾病综合征的最常见的病理类型之一，近年来发病率呈逐年上升的趋势[1]，具有临床表现多样、预后差别大以及易并发血栓等特点，有约1/3的患者表现为持续蛋白尿伴有肾功能进行性减退，最终可进展至终末期肾衰竭，而经过积极治疗可有效改善患者预后，若能尽早筛选出预后不良的高危患者及危险因素，给予早期干预至关重要。目前对于IMN患者临床病理资料的分析较多，结论普遍认为男性、高龄、大量蛋白尿者、病理分期高、肾小管间质损伤者预后差，而针对生活习惯或环境因素对IMN临床病理变化的研究较少。近年来，吸烟在肾脏疾病的发生发展中的作用逐渐引起我们的关注，不同的研究显示吸烟对不同类型的肾脏疾病，其损害有所不同。目前国内外鲜有针对IMN患者吸烟状态的数据报道及吸烟对IMN临床病理影响的相关研究，因此本研究通过对318例IMN患者的临床病理资料及吸烟状态进行统计分析研究，以期提高医生及患者对吸烟相关肾损害的认识，并对控烟策略的制定及深入研究提供理论依据。4.1一般资料讨论本研究共纳入IMN患者318例，其中男性202例（63.5%），女性116例（36.5%），男：女=1.74：1，与我中心2010年1月-2014年12月关于IMN统计资料相比，女性所占比例（28.2%）有所升高，差异有统计学意义（P<0.05），可能与近年来随着人们生活水平的改善和提高，女性染发及使用化妆品增多致重金属（如汞）的暴露增多等有关。发病年龄分布在17～84岁，平均年龄为50.97±12.99岁,发病年龄主要在45～59岁区间，占43.34%，与既往文献报道基本一致[60]。城乡比为0.64：1，乡村患者居多，可能与农村患者务农过程中使用农药化肥、现代农村环境污染加重而治理差以及人们对健康重视程度有关。4.2IMN患者吸烟状态讨论吸烟是全球性危害公共卫生健康的问题，我国更是烟草大国，吸烟对于国28 第4章讨论民健康的影响较为严峻，我国有关吸烟的流行病学调查显示，中国公民吸烟率为35.8%，目前我国的烟草使用较以往已达到高峰期，且无明显的降低趋势，女性吸烟率逐渐升高，吸烟年龄呈现年轻化的改变。本研究IMN患者中吸烟率为26.1%，男性吸烟率为37.1%，女性为8.9%，符合东北地区女性吸烟率较高的特点，但总体吸烟率及男性吸烟率低于国内普通人群调查水平，可能与调查人群构成差异有关。青年组吸烟率为20%，中年组吸烟率为30.8%，老年组吸烟率为25%，男性、中老年人群吸烟率高，提示这部分人群应列为控烟工作的重点，青年吸烟率略低于中年组及老年组，但差异无统计学意义，且本次调查显示戒烟者全部为中老年，说明青年人群对吸烟有害性的认识不足，吸烟问题在青年人群中的控制尚需加强。此外东北地区女性吸烟率高，且上述研究显示IMN女性所占比例较前有所增加，因此女性吸烟问题亦不容忽视。本次电话回访54例IMN目前吸烟者，14例（25.9%）戒烟，32例（59.3%）表示吸烟量较患病前减少，8例（14.8%）吸烟量较前无明显改变。54例回访者中吸烟对肾脏损害知晓者仅11例（20.4%），46例（85.2%）受访者表示患病是其戒烟或吸烟量减少的主要原因。上述结果显示，吸烟对肾脏损害知晓率及戒烟率低，可能与医务人员认识不足和对患者宣教欠缺以及部分患者依从性差有关，这也提示我们，在以后的临床工作中需加强吸烟相关肾损伤的宣教。4.3临床资料讨论吸烟组与非吸烟组相比男性所占比例明显增高，差异有统计学意义，与我国吸烟者以男性为主相符。吸烟组血尿素氮、血肌酐、血尿酸、血红蛋白水平增高，高于非吸烟组，差异有统计学意义。考虑到正常情况下男性血尿素氮、血肌酐、血尿酸、血红蛋白的基础水平高于女性，且吸烟组与非吸烟组在男性比例上有显著差异，为祛除性别差异对统计结果的影响，进一步对吸烟中男性患者与非吸烟中男性患者进行检验对比，发现吸烟组血尿素氮、血肌酐、血尿酸、血红蛋白水平虽较非吸烟组偏高，但差异无统计学意义。因此，尽管吸烟可能会对上述临床指标造成一定影响，但性别因素的影响不容忽视。我们注意到IMN患者血红蛋白平均水平偏高，尤其是吸烟组患者，可能与以下因素有关：①.IMN患者以肾病综合征为主要临床表现，低蛋白血症引起血胶体渗透压的29 第4章讨论下降，使血管内液体外渗，血液浓缩。②.血红蛋白（Hb）的主要作用为输送氧气，可与O2可逆性结合，吸烟过程中烟草产生CO，CO可与Hb结合，占据Hb与O2结合位点，而且与Hb的亲和力要显著高于O2，因此即使在低量的PCO条件下，CO即可从HbO2中取代O2，此外CO还可妨碍Hb对O2的解离，所以吸烟者体内存在不同程度的缺氧状态，Hb代偿性增加致使血液粘稠，引发不良后果。4.4吸烟对IMN患者肾功能影响分析近年来，国内外一些研究结果显示吸烟是肾损害发生和发展中的一个重要危险因素，吸烟对于肾脏的损害作用逐渐得到大家的关注，一项关于高血压患者的前瞻性研究显示[61]，高血压患者中，吸烟者与非吸烟者相比较，肾功能减退的速度明显增快。对糖尿病肾病患者的研究显示，吸烟可明显缩短糖尿病肾病进入终末期肾功能衰竭的时间[62]。RyoheiY等人对IgA肾病的患者进行回顾性分析研究显示：吸烟是IgA肾病患者肾功能衰退的独立危险因素[63]。本研究显示吸烟组较非吸烟组eGFR水平降低，差异有统计学意义，说明吸烟对IMN患者肾功能具有一定的损害作用。单因素相关性分析显示，eGFR与吸烟无明显相关性，与上述关于其他肾脏疾病的研究结果不同，考虑可能与IMN本身病变特点以及影响肾功能的因素具有多样性有关。进一步行多因素回归分析显示eGFR与年龄及24h尿蛋白定量呈负相关，提示年龄和24h尿蛋白定量是IMN患者eGFR降低的独立危险因素，与既往研究相符。多因素回归分析结果显示eGFR与收缩压无明显相关性，说明eGFR与收缩压之间存在共变趋势，但两者之间可能为相互影响关系。4.5吸烟对IMN患者肾脏病理影响分析既往动物研究显示尼古丁作为烟草最主要的有害成分之一，可造成肾组织系膜增生、肾间质纤维化、小管损伤及血管内膜增厚等病变[4-7]，导致这些损害的机制可能包括内皮细胞功能障碍、血管活性因子增多、氧化应激。体外研究发现尼古丁可通过激活乙酰胆碱受体，增加转化生长因子-β（TGF-β）的表达，导致系膜细胞、系膜基质的增生和血管内皮细胞的损伤，此外新的研究显示吸30 第4章讨论烟导致人体高剂量重金属镉和铅的暴露，它们具有肾脏毒性，并且易在人体，尤其是肾脏蓄积，研究显示吸烟致肾小管损伤的作用与职业镉暴露之间存在协同现象[8][9]。KanauchiM等人对2型糖尿病患者肾活检组织病理研究发现吸烟与肾间质损害独立相关[64]。既往关于肾移植患者肾活检病理资料的研究发现，吸烟与肾脏小血管壁增厚相关[65]。本研究结果显示吸烟组与非吸烟组相比较，肾间质血管总分、肾小管萎缩、血管壁增厚方面差异有统计学意义。对肾间质血管总分行相关性分析显示，与吸烟、年龄、收缩压、舒张压呈正相关，进一步多因素回归分析显示，肾间质血管总分与年龄、吸烟呈正相关，说明吸烟和年龄是IMN患者肾间质血管病变加重的独立危险因素。综上，吸烟对IMN患者肾功能具有一定的损伤作用，而且是IMN肾间质血管损伤的独立危险因素，吸烟是一种可干预的不良生活方式，控烟或戒烟是延缓疾病进展，改善疾病预后最为经济有效的方式之一，因此应当重视IMN患者的吸烟状态，积极有效的帮助和指导患者戒烟。4.6BAFFmRNA在IMN患者体内表达分析目前认为IMN是一种抗原抗体介导的自身免疫性疾病，国内外多项研究发现IMN患者体内B淋巴细胞水平明显增高，病情缓解后此异常可以恢复[19]。使用能够抑制B淋巴细胞增殖，诱导细胞凋亡的抗B细胞表面抗原CD20的利妥昔单抗可以使IMN患者的蛋白尿得到缓解[20][21]。此外，既往研究显示在IMN患者可见B淋巴细胞局灶聚集于肾间质，且B淋巴细胞聚集密度明显高于局灶节段肾小球硬化和微小病变性肾病的患者[12][22]。免疫荧光检测IMN患者肾组织，主要以IgG呈颗粒状沿GBM沉积，大部分同时伴有补体C3的沉积，其中以IgG4亚型为主，本研究中43例入选的IMN患者免疫荧光病理显示IgG4均为阳性（+～++）。有研究证实，IMN患者体内的B淋巴细胞分泌IgG4亚型的能力明显增多[22]，因此大多数学者认为B细胞功能异常在IMN的发病过程中起着重要的作用。B细胞活化因子（BAFF）经研究显示能通过刺激和共刺激作用显著的诱导B淋巴细胞的增殖、激活及免疫球蛋白的合成分泌以及抗体类别的转化，主要表达于髓样单核细胞系，BAFF与其受体特异性结合发挥上述作用[66-67]。既往研31 第4章讨论究表明吸烟可使人和动物体内BAFF表达水平增高。本研究结果显示吸烟的IMN患者体内BAFFmRNA表达水平与非吸烟的IMN患者相比偏高，但差异无统计学意义，可能与BAFFmRNA的表达受多种因素的影响，如体内T细胞功能、细胞因子干扰素（INF）-γ和白介素（IL）-10以及IL-4等[68-69]，此外亦有可能与本部分实验样本量较少有关，有待进一步深入研究。近年越来越多的研究证实BAFF参与多种自身免疫性疾病的发生，在系统性红斑狼疮（SLE）、干燥综合征及IgA肾病等患者体内BAFF水平升高。本实验以检测外周血单个核细胞BAFFmRNA表达水平为切入点进行研究，结果显示：IMN患者BAFFmRNA水平较健康对照组明显增高，差异有统计学意义，且BAFFmRNA表达水平与24h尿蛋白定量呈正相关，表明BAFFmRNA的过度表达可能在IMN的发病过程发挥重要作用，至于BAFFmRNA高表达在IMN的发生、发展及预后中的具体影响还需要进一步大样本的深入研究。特异性与仅在B细胞表面表达的CD20相结合的利妥昔单抗已经开始被应用于IMN的治疗中。多项小样本研究结果显示利妥昔单抗在IMN的治疗过程中显示出较好的缓解率，且对于免疫抑制治疗无效或效果较差的患者仍然有效[70-71]，而且由于具有靶向性的特征，相对来说安全性会更高。基于我们上述的研究，IMN患者体内存在BAFFmRNA的高表达，且有研究显示IMN患者体内BAFF水平同样是增高的，作为导致B淋巴细胞异常活化的重要部分，具有良好的B细胞靶向性，针对BAFF高表达的治疗或者以BAFF为载体的靶向治疗有可能成为IMN治疗的新思路。目前BAFF拮抗剂主要包括贝利单抗、Blisibimod、Atacicept、Tabalumab。除贝利单抗已于2011年被美国食品药品管理局批准用于难治性SLE的治疗外，其他几种目前尚处于临床试验当中，它们通过中和体内BAFF，从而阻断BAFF与其受体结合，使B淋巴细胞活化信号中断，包括自身反应性B细胞。多项针对贝利单抗治疗SLE的研究显示：贝利单抗可明显改善SLE反应指数，减少疾病活动及严重发作，且临床耐受良好[72]。这些新兴药物对IMN的治疗是否有效，是否同样表现出良好的安全性，尚需要大量的基础和临床研究。以BAFF为药物载体的靶向治疗，有导致B淋巴细胞异常活化的潜在危险，目前在关于B淋巴瘤治疗的研究中有研究者们使BAFF的结构改变体32 第4章讨论mBAFF作为载体取得了令人满意的效果[73]。mBAFF是将BAFF分子中217-224的八个氨基酸由两个甘氨酸替代而获得，在保留针对B淋巴细胞靶向特异性的同时丧失了使B细胞活化的功能，另外除了作为载体，mBAFF还可竞争性抑制BAFF活化B细胞。如果我们将治疗IMN效果较满意的药物脂质体如CNI等与mBAFF相偶联，进而进行靶向治疗，是否能在减少药物不良反应的同时取得良好的疗效，值得我们进一步深入探索。33 第5章结论第5章结论1、IMN患者中吸烟率为26.1%，男性吸烟率高，吸烟者戒烟率为26.5%，吸烟相关肾损害知晓率低。2、吸烟对IMN患者肾功能具有一定的损害作用，是IMN肾间质血管损伤的重要危险因素。3、BAFFmRNA在IMN患者体内的高表达可能在IMN的发病机制中发挥重要作用，而吸烟对IMN患者体内BAFFmRNA的表达无明显影响。34 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