蜥蜴胃康基本方及其拆方对胃癌前病变SD大鼠模型P53、PUMA影响的实验研究

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分类号：R2单位代码：10752密级：公开学号：201400148宁夏医科大学硕士研究生学位论文蜥蜴胃康基本方及其拆方对胃癌前病变SD大鼠模型P53、PUMA影响的实验研究ExperimentalStudyonTheEffectsofP53、PUMAProteinWithTheLizardWeikangBasicPrescriptionandTheDifferentCombinationonPrecancerousLesionofGastricCancerinModelSDRats学位申请人：侯卓成指导教师：李卫强副教授申请学位门类级别：医学专业名称：中医临床基础研究方向：脾胃病的基础与临床研究所在学院：中医学院论文完成日期：二〇一七年三月宁夏医科大学研究生院 NingxiaMedicalUniversityThesisforApplicationofMaster’sDegreeExperimentalStudyonTheEffectsofP53、PUMAProteinWithTheLizardWeikangBasicPrescriptionandTheDifferentCombinationonPrecancerousLesionofGastricCancerinModelSDRatsStudent’sName:HouZhuochengSupervisor:AssociateprofessorLiWeiqiangSubjectCategory:MedicineMajor:TraditionalChinesemedicineclinicalbasicSpecialty:BasicandclinicalresearchofdigestivesystemofTraditionalChinesemedicineCollege:TraditionalChinesemedicineschoolCompletionDate:Mar.2017 宁夏医科大学学位论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是个人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，无抄袭及编造行为。除文中已经特别加以注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明并致谢。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。论文作者签名论文导师签名１Ｈｊ＞ｆ年ｔ月７／夕日＞／｜年９月Ｋ日］宁夏医科大学关于学位论文使用授权的声明ｙ宁夏医科大学有权保留使用本人学位论文，同意学校按规定向国家有关部门机构送交论文的复印件和电子版，允许被查阅和借阅。本人授权宁夏医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复印手段保存和汇编本学位论文。可以公布（包括刊登）论文的全部或部分内容。（保密论文在解密后应遵守此规定）￣ｖｔ论文作者签名论文导师签名ｔＭ＞Ｔ年玄月ｉ日年ｓ月＆曰／ 宁夏医科大学硕士学位论文中文摘要蜥蜴胃康基本方及其拆方对胃癌前病变SD大鼠模型P53、PUMA影响的实验研究摘要目的：探讨蜥蜴胃康基本方及其补气组、养阴组、解毒通络组拆方药物分别对胃癌前病变（PLGC）模型大鼠胃黏膜细胞增殖、凋亡以及对P53、PUMA水平的影响，阐明该方干预PLGC的作用机制，为临床治疗提供依据。方法：实验动物选取雄性SD大鼠，SPF级，总共70只，运用随机分配方式，将其分为空白对照组（A组），模型对照组（B组），补气组（C组），养阴组（D组），解毒通络组（E组），全方组（F组），维霉素对照组（G组），共7组，每组10只。除空白对照组常规饲养外，其余各组大鼠采用浓度为0.02mol/L的N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍（MNNG）溶液灌胃及自由饮用、40%乙醇灌胃、饥饱失常（2d饱食，ld饥饿）等综合造模法制备PLGC大鼠模型，共计24周。24周后每组随机抽取1只造模大鼠处死取材，并做病理检测。病理检测以证明符合PLGC病理诊断标准后，空白对照组继续常规饲养，模型对照组使用生理盐水灌胃，而其他各治疗组则分别给予相应治疗药物灌胃，2次/日，连续治疗12周。观察各组大鼠一般情况，在给药第12周末，将各组大鼠禁食禁水24h，麻醉后处死,观察模型大鼠HE染色后胃黏膜病理组织学的改变情况；免疫组织化学染色检测P53和PUMA因子表达情况。运用SPSS18.0统计软件进行数据分析。结果1.一般情况：空白对照组大鼠体形肥胖，行动灵敏，精神状态佳，皮毛有光泽，进食进水量良好，大便正常；模型对照组大鼠形体消瘦，活动较少，精神萎靡，皮毛暗淡，进食进水量减少，便软；各治疗组大鼠一般情况良好，上述表现较模型对照组均有不同程度的改善。II 宁夏医科大学硕士学位论文中文摘要2.病理组织学观察：通过肉眼观察发现：空白对照组大鼠的胃黏膜色泽正常，呈粉红色，形态完整，黏膜光滑，黏液较多；模型对照组大鼠胃黏膜尚完整，有散在出血点及糜烂部位，呈暗灰白色，表面欠光滑。各治疗组大鼠胃黏膜尚完整，情况较模型对照组有一定改善。其中全方组大鼠胃黏膜恢复效果最为明显。镜下观察可见：空白对照组大鼠胃黏膜胃黏膜结构正常；模型对照组大鼠胃黏膜有不同程度的萎缩及化生等情况出现；各治疗组大鼠胃黏膜的萎缩及肠上皮化生、异型增生有不同程度改善，其中以全方组大鼠胃黏膜改善情况较明显。3.免疫组化结果：模型对照组、各治疗组与空白对照组比较，P0.05；各治疗组与模型对照组比较，P0.05；补气组、养阴组、解毒通络组与全方组比较，P0.05，其中以P53全方组AOD值最低，PUMA全方组AOD值最高，显示全方组的治疗效果最明显；各拆方治疗组（补气组、养阴组、解毒通络组）比较，P0.05，其中以补气组AOD值最低，也说明了补气组的治疗效果最明显；各拆方治疗组与维酶素对照组相比较，差异有统计学意义，P0.05。结论1.蜥蜴胃康基本方及其拆方可以改善PLGC模型大鼠体重变化，活动及存活情况、精神状态、毛色、进食进水量、大便情况等一般情况。2.蜥蜴胃康基本方及其拆方可以改善PLGC模型大鼠胃黏膜腺体萎缩、肠上皮化生及异型增生情况。3.蜥蜴胃康基本方及其拆方可以影响P53、PUMA的表达，诱导肿瘤细胞发生凋亡。4.蜥蜴胃康基本方的全方组对修复胃黏膜损伤优于各拆方组，各拆方组比较，以补气组对胃黏膜损伤的修复作用较养阴组和解毒通络组强。关键词：胃癌前病变，蜥蜴胃康基本方，P53，PUMAIII 宁夏医科大学硕士学位论文英文摘要ExperimentalStudyonTheEffectsofP53、PUMAProteinWithTheLizardWeikangBasicPrescriptionandTheDifferentCombinationonPrecancerousLesionofGastricCancerinModelSDRatsABSTRACTObjectiveTheobjectiveofthisstudywastoexploretheLizardsweikangbasicprescription,tonicprescriptionsofQigroup,nourishingtheYingroup,relievingtoxicityanddredgingmeridiansgrouponthegastricmucosacellproliferation,apoptosisandP53levelofPLGCmodelrats.Furthermore,itsmechanismofactiononPLGCwasexpounded,theclinicalapplicationoftheprescriptiontoprovidethebasisfortreatmentofPLGC.Methods70SPF,SDmalerats,4to6weeks,wererandomlydividedintoblankcontrolgroup(A),PLGCinmodelcontrolgroup(B),tonicprescriptionsofQigroup(C),nourishingtheYingroup(D),relievingtoxicityanddredgingmeridiansgroup(E),theLizardsweikangbasicprescriptiongroup(F),Vitacoenzymetreatmentgroup(G).Therearealtogethersevengroupsinthisexperimental,and10ratsineachgroup.Inadditiontotheblankcontrolgroupfeedingconventionally.Othergroupsuse0.02mol/LN-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine(MNNG)and40%ethanoltolavage,andalsocandrinkMNNGfreely.Furthermore,itincludehungerdisturbance(2dsatiety,ldhunger)comprehensivefactors.Intheaggregateof24weekstobuildingthemodelforthePLGCofrat.After24weeks,1ratrandomlychosenfromeachgroup,andkillthemtoconfirmthepathologicaldiagnosiscriteriaofPLGC.Aftermakemodelbuildingsuccessfully,throughthepathologicaldetection,theblankcontrolgroupandPLGCinmodelcontrolgroupweregivensalinelavage,whileothergroupsweregivencorrespondinglavagetreatmentdrugs.Allofthemweregivendrugs2times/dayandfor12IV 宁夏医科大学硕士学位论文英文摘要continuousweeks.Observethegeneralconditionofeachgroup,andattheendof12thweek,snappingtheratsfastingthewaterfor24h,thennarcotizeandputtodeaththerates.Afterthisprocess,observedthehistopathologicalchangesofgastricmucosa,andtheroutineHEstainingwasusedtoobservethehistopathology.DetectthefactorP53andPUMAexpressionbyimmunohistochemiclmethd.Atlast,statisticaldatawereusedtoanalyzetheexperimentaldata.Results1.Generalsituation:blankcontrolgroupofratsisobesity,verysensitive,andingoodspirits.Theirfurarebright,faecesarenormal,andtheirdietareasusual.PLGCinmodelcontrolgroupofratsisemaciation.Theseratsactivitiesless,listlessness,furbleak,eatingwaterreduced,softstools.Eachtreatmentgroupsaregenerallyingoodcondition,andtheaboveperformanceisbetterthanthatofPLGCinmodelcontrolgroup.2.Histopathologicalobservation:Foundbynakedeye,blankcontrolgroupofgastricfoldsshapenormal,theshapeandcolorarenormal,thepink.Mucousmembraneofgastricmucosaissmooth,andmucusismore.ThePLGCinmodelcontrolgroupgastricfoldsdisorder,thebleedingpointsanderosioninscattered,thedarkwhite,andgastricmucosalsurfaceisnotsmooth.Eachtreatmentgroupsaregenerallyingoodcondition.TherecoveryofgastricmucosaoftheLizardsweikangbasicprescriptiongroupwasthemostobvious.Foundbythemicroscopic,blankcontrolgroupofgastricfolds’structureisnormal.ThePLGCinmodelcontrolgroupgastricfoldsaredifferentdegreesofatrophyandintestinalmetaplasiaanddysplasia.Eachtreatmentgroupsonthegastricmucosa’satrophyandintestinalmetaplasiaanddysplasiawasimprovedindifferentdegrees,mostofall,theLizardsweikangbasicprescriptiongroupimprovedsignificantly.3.Immunohistochemicalresults:ComparisonbetweenPLGCinmodelcontrolgroup,Eachtreatmentgroupsandblankcontrolgroup,(P0.05);ComparisonbetweeneachtreatmentgroupsandPLGCinmodelcontrolgroup,(P0.05);ComparisonoftonicV 宁夏医科大学硕士学位论文英文摘要prescriptionsofQigroup,nourishingtheYingroup,relievingtoxicityanddredgingmeridiansgroupandheLizardsweikangbasicprescriptiongroup,(P0.05);Amongthem,thelowestAODvalueintheLizardsweikangbasicprescriptiongroup,theresultsshowedthatthetreatmenteffectofthisgroupwasthemostobvious;ComparisonbetweentonicprescriptionsofQigroup,nourishingtheYingroupandrelievingtoxicityanddredgingmeridiansgroup,(P0.05);andthelowestAODvalueintonicprescriptionsofQigroup,theresultsshowedthatthetreatmenteffectofthisgroupisbetter;ThetonicprescriptionsofQigroup,nourishingtheYingroupandrelievingtoxicityanddredgingmeridiansgroupcomparedwithVitacoenzymetreatmentgroup,(P0.05).Conclusion1.TheLizardsweikangbasicprescriptionandthedifferentcombinationcanimprovethebodyweightchange,activityandsurvival,mentalstate,haircolor,intakeofwater,stool,andothergeneralsituationinratswithprecancerouslesionsofgastriccancer.2.TheLizardsweikangbasicprescriptionandthedifferentcombinationcanimprovegastricprecancerouslesioninaratmodelofgastricmucosaglandatrophy,intestinalmetaplasiaanddysplasia.3.TheLizardsweikangbasicprescriptionandthedifferentcombinationcaninfluencetheexpressionofP53andPUMAproteininprecancerouslesionsofgastriccancer.4.AmongthedifferentcombinationofLizardsweikangbasicprescription,thetonicprescriptionsofQigroupisbetterthannourishingtheYingroupanddredgingmeridiansgroupintherepairofgastricmucosalinjury.KeywordsPrecancerouslesionsofgastriccancer,theLizardweikangbasicprescription,P53,PUMAVI 宁夏医科大学硕士学位论文中英文缩略表中英文缩略表PLGCPrecancerousLesionsofGastricCancer胃癌前病变CAGChronicAtrophicGastritis慢性萎缩性胃炎GCGastricCancer胃癌LWBPLizardWeikangBasicPrescription蜥蜴胃康基本方PUMAP53upregulatedmodulatorofapoptosisP53上调凋亡调控因子EDTAEthyleneDiamineTetraaceticAcid乙二胺四乙酸IMIntestinalMetaplasia肠上皮化生DysDysplasia异型增生HPHelicobacterPylori幽门螺杆菌AODAverageOpticalDensity平均吸光度ELISAEnzyme-linkedImmunosorbnentAssay酶联接免疫吸附剂测定COX2Cyclooxygenase-2环氧化酶-2PGE2ProstaglandinE2前列素E2MDAMalondialdehyde丙二醛IHCImmunohistochemistrytechnique免疫组织化学技术CLEConfocalLaserEndomicroscopy共聚焦激光显微内镜MNNGN-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidineN-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍VII 宁夏医科大学硕士学位论文目录目录前言.........................................................................................................................................1材料与方法................................................................................................................................31.实验材料与仪器...............................................................................................................31.1实验动物.................................................................................................................31.2实验药物.................................................................................................................31.3实验试剂.................................................................................................................31.4实验仪器与设备.....................................................................................................42.实验方法...........................................................................................................................42.1药物配制方法.........................................................................................................42.2动物分组方法.........................................................................................................52.3动物模型制备.........................................................................................................52.4给药方法及给药剂量.............................................................................................63.标本采集与制备...............................................................................................................64.指标检测的方法步骤.......................................................................................................64.1HE染色..................................................................................................................64.2免疫组化显色.........................................................................................................74.3观察指标及检测方法.............................................................................................85.统计学分析.......................................................................................................................8结果.........................................................................................................................................91.一般情况...........................................................................................................................92.大鼠体重变化...................................................................................................................93.实验大鼠胃黏膜病理组织学观察.................................................................................103.1肉眼观察...............................................................................................................103.2HE染色光镜下观察............................................................................................104.免疫组化统计结果.........................................................................................................114.1各组大鼠P53、PUMA蛋白的表达...................................................................11讨论.......................................................................................................................................131.PLGC大鼠模型制备.....................................................................................................132.PLGC的病因病机.........................................................................................................143.蜥蜴胃康方组方分析.....................................................................................................154.蜥蜴胃康方现代药理研究.............................................................................................175.P53、PUMA与PLGC的关系......................................................................................216.蜥蜴胃康基本方及其拆方对PLGC模型大鼠P53、PUMA的影响.........................23结论.......................................................................................................................................24参考文献..................................................................................................................................281.PLGC的诊断研究................................................................................................................331.1肿瘤标志物诊断在PLGC的研究.............................................................................331.2内镜诊断在PLGC的研究.........................................................................................342.PLGC治疗研究....................................................................................................................36VIII 宁夏医科大学硕士学位论文目录2.1根除Hp感染...............................................................................................................362.2化学药物治疗..............................................................................................................372.3PLGC的内镜下治疗..................................................................................................372.4中医药对于PLGC的治疗.........................................................................................383.问题与展望.....................................................................................................................39综述参考文献..........................................................................................................................40致谢...........................................................................................................................................43攻读学位期间发表的学术论文..............................................................................................44个人简历..................................................................................................................................45IX 宁夏医科大学硕士学位论文前言前言胃癌（GastricCancer,GC）在我国各地均有分布，尤其以东南沿海及西北地区发病率高，总体来说，我国属于胃癌的高发区。据报道[1]，2012年中国胃癌新发病例约为40.5万，该数据占全世界发病人数的42%，而我国胃癌死亡率大约为22/10万[2]，发病率和死亡率在全世界范围内均处于较高的水平。胃癌已经成为我国消化道恶性肿瘤死亡率的首位疾病[3]，严重威胁我国人民的健康，并给社会带来十分巨大的经济压力。因此对于胃癌的预防尤为重要。近年来，饮食因素、感染因素、遗传因素、免疫因素及理化因素等已经能够直接或间接影响到胃癌的发生发展，这方面已经得到流行病学资料的证实。高盐饮食能够直接损伤胃黏膜、抑制前列腺素E的合成、以及产生亚硝酸胺，促进胃癌的发生；含有杂色曲霉等毒素的霉变食物能够造成霉菌感染，因而也是导致胃癌的危险因素之一；酒精能够损伤胃黏膜，导致黏膜糜烂，使发病的风险增高；某些细菌、病毒如HP感染也是导致特殊肿瘤发生的强有力的危险因素；而基因的突变，也能够对细胞的增殖与分化造成一定的影响，增加细胞癌变的几率；此外，某些理化因素，如N-亚硝基化合物、多环芳羟化合物以及某些电离辐射等，也都是与胃癌相关的高危因素。细胞在多种因素长期作用下，其基因的结构与表达发生了异常的变化，造成某些癌基因被激活，抑癌基因失活等都能够进一步发展为胃癌。因此对胃癌病因学的预防，能更加有效地避免致癌因素的侵袭。早期胃癌患者缺乏特异性症状，诊断较困难，因此对胃癌的预防，特别是发病学的预防则尤为关键。但是目前胃癌发病机理尚不明确，有效的预防难以开展。因此，我们对于胃癌前病变的阻断能够成为为预防早期胃癌的一个有效途径。胃癌前病变（Precancerouslesionsofgastriccancer,PLGC）是一种病理性概念，是指胃癌前疾病如萎缩性胃炎(ChronicAtrophicGastritis,CAG)伴有肠上皮化生（IM）和异形增生（Dys），这种病理组织学改变有明显的癌变危险。胃黏膜上皮的IM是胃部的固有腺膜出现类似于1 宁夏医科大学硕士学位论文前言小肠或者大肠黏膜上皮的现象。轻度IM是原有部位出现了单个的杯状细胞，而重度IM则会出现大量的腺管，甚至取代了原有的腺管。此时多出现吸收细胞、杯状细胞等细胞。胃黏膜上皮的Dys主要是细胞及腺体结构的分化异常和异型，在形态上或者是与胃癌相关抗原的表达上，都与胃癌细胞和组织有一定程度上的相似性。此时，腺体结构形状不规则，腺体排列不整齐，出现融合，迂曲等现象。而上皮细胞的异型表现为：增生的细胞大小不一，形态多样，排列不齐。细胞核变大并有较深的染色；分化异常表现为：细胞的分泌功能出现减退，甚至消失。胃癌前疾病演变为胃癌需要一个较长的过程。对该过程进行有效干预，能够明显降低胃癌的发病率以及死亡率[4]。对PLGC的预防，就是通过化学药物及中医药，甚至是营养方面的干预来对PLGC进行有效的阻断。PLGC是一个漫长的过程，该过程伴随着许多基因的变化。正常细胞基因组中P53为野生型。该型P53在基因受到损伤后大量表达，对轻度DNA损伤进行修复，若损伤较重则诱导细胞凋亡。PUMA(p53Up-regulatedModulatorofApoptosis)基因，是P53下游的靶基因，是p53基因诱导凋亡中的一种介质。P53和PUMA在PLGC发展到胃癌的过程中发挥着重要的作用。中医药依靠其整体观念的指导和辨证论治的应用，以及毒副作用小等特点，在PLGC的临床防治中具备优势。导师通过多年临床和实验研究，通过病例收集及聚类分析后，认为PLGC患者以气阴亏虚、毒瘀交阻的虚实关联证候为主[5]，并在临床当中，确立了益气养阴、解毒通络的基本治疗思路，并使用蜥蜴胃康基本方来治疗PLGC。拆方研究是在中医药理论指导下，对复方进行有效拆解，以探讨复方组方原理和配伍理论的一种研究方法。拆方研究能够阐明方剂配伍的科学性，寻求药物的最佳配伍比例，确定发挥主要作用的药物，此外还能够使得方剂变得精简，减少复方的药物用量。本次研究将蜥蜴胃康基本方拆为补气、养阴及解毒通络组进行药物研究，以便更好地阐明该复方配伍的合理性和科学性。本次实验我们探讨蜥蜴胃康基本方及其拆方阻断PLGC的作用机制，以便更好地为临床应用该方提供依据。2 宁夏医科大学硕士学位论文材料与方法材料与方法1.实验材料与仪器1.1实验动物SPF级雄性SD大鼠70只，6-7周龄，体质量140-180g。大鼠及大鼠饲料均由宁夏医科大学实验动物中心提供。动物合格证编号:SCXK(宁)2011-0001；大鼠饲料产品批号:12083123。1.2实验药物造模药物为N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍（MNNG）溶液，由东京化成工业株式会社提供，批号：A45400A。蜥蜴胃康基本方药物组成：太子参、黄芪、甘草、石斛、乌梅、炒白芍、半枝莲、蛇莓、蜥蜴、枳壳、三七粉，均由宁夏医科大学附属回医中医门诊部提供。维酶素片：每片0.2g，由新乡恒久远药业提供，批号:20120208。95%无水乙醇，由乌海三鑫药业提供。0.9%氯化钠溶液，由宁夏医科大学附属回医中医门诊部提供，批号：1408260408。1.3实验试剂兔抗大鼠多克隆P53抗体（批号：BA2878）；兔抗大鼠多克隆PUMA抗体（批号：BA1802）；均由博士德公司提供。PV-6001通用型二步法免疫组化检测试剂盒，批号：K133319E；ZLI-9018浓缩型DAB显色试剂盒，批号：K135222E。柠檬酸盐缓冲液ZLI-90641000ml/袋Citrate(0.01MpH6.0)：PBS磷酸盐缓冲液ZLI-90622000ml/袋Citrate(0.01MpH7.2～7.4)，均有由中杉金桥公司提供。3 宁夏医科大学硕士学位论文材料与方法1.4实验仪器与设备YB-6CF行包蜡机与RM2235型石蜡切片机由上海莱卡公司提供；YT-6C型摊烤片机由孝感亚光医用电子有限公司提供；ZT-12P型生物组织自动脱水机由湖北亚光医用电子技术公司提供；超低温冰箱BCD-201/HC由广东科龙电器提供；隔水式恒温培养箱GNP-9080型由上海精宏实验设备公司提供；超净工作台YJ-1450型由苏州净化设备公司提供；微量移液器由德国EP-Pendorf公司提供；显微镜BH2-RFCA由日本OLYMPUS公司提供。2.实验方法2.1药物配制方法（1）MNNG溶液：取1gMNNG与1L的蒸馏水配置成溶液，在使用时配置成浓度约为0.02mmol/L的稀释液，以供大鼠自由饮用及灌胃。该溶液使用及贮藏时均使用深棕色，能够避光的容器，其余溶液置于4℃冰箱保存。（2）维酶素混悬液：将维霉素片称重后，研为细末，并与0.9﹪氯化钠溶液配制成0.1g/ml的混悬液，搅拌使其充分溶解，置于4℃冰箱中保存。（3）蜥蜴胃康基本方及拆方的中药煎液：将中药按照拆方分为四组：补气组、养阴组、解毒通络组及全方组。其中补气组的药物组成：太子参、黄芪与甘草；养阴组药物组成：炒白芍、石斛及乌梅；解毒通络组药物组成：蜥蜴、枳壳、半枝莲、蛇莓及三七粉；全方组包括以上所有中药。将各组中药分别浸泡30min后，用砂锅煎煮，煎煮用水需没过中药材。煎煮至沸腾后，继续使用文火煎煮30min后，取其煎液继续浓缩至所需剂量为止。其中补气组药物浓度为0.50g/ml；养阴组药物浓度为0.35g/ml；解毒通络组药物浓度为0.47g/ml；全方组药物浓度1.3g/ml。以上煎液装瓶于冰箱中保存，以供使用。（4）10﹪水合氯醛：将10g水合氯醛中加入70ml左右的蒸馏水中，使其充分溶解，4 宁夏医科大学硕士学位论文材料与方法继续加入蒸馏水配满100ml，以配制成10﹪的水合氯醛，室温保存。（5）40%乙醇配置：通过计算，取95%乙醇210.5ml，加289.5ml的蒸馏水，即配置为40%乙醇500ml，装瓶备用，室温保存。（6）0.01M磷酸缓冲盐溶液（PBSPH7.2）：将1袋PBS结晶与2000ml蒸馏水混合，充分溶解，装瓶备用，室温保存。（7）柠檬酸盐缓冲液（0.01MpH6.0）：将29.41g柠檬酸钠和21g柠檬酸分别与1000ml蒸馏水充分混匀，配成柠檬酸钠溶液及柠檬酸溶液。然后分别取柠檬酸钠溶液9.5ml，柠檬酸溶液40.5ml加蒸馏水450ml配置成柠檬酸盐缓冲液，装瓶备用，室温保存。（8）DAB显色液：按照1滴DBA浓缩液与1mlDBA底物液的比例，配制成DAB工作液，避光保存，现配现用。2.2动物分组方法将70只雄性SD大鼠随机分为7组：空白对照组（A组），模型对照组（B组）、补气组（C组）、养阴组（D组）、解毒通络组（E组）、全方组（F组）、维霉素组（G组），每组10只大鼠，标准饲料喂养，自由饮水，室温24℃左右，湿度55%左右，适应性饲养一周。一周后，A组大鼠不做任何处理，其余各组大鼠均进行PLGC的造模。2.3动物模型制备查询相关文献[6]，结合实际情况，确定了本次实验的大鼠PLGC模型方法。除空白对照组常规饲养外，其余各组大鼠采用的N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍（MNNG）溶液灌胃及自由饮用，其中MNNG的浓度为0.02mol/L，灌胃的频率为1次/日；并给予40%乙醇灌胃，灌胃的频率为3次/周；再结合2日饱食，1日饥饿的饥饱失常法共同制备PLGC大鼠模型，整个制备过程共计24周。造模24周后，随机选取2只大鼠处死，取胃黏膜做病检，以证明符合PLGC的病理诊断。整个造模期间模型对照组死亡大鼠25 宁夏医科大学硕士学位论文材料与方法只，养阴组和维酶素对照组各死亡1只。经病理检测证明其中模型对照组2只死亡大鼠有IM和Dys情况出现。2.4给药方法及给药剂量造模成功后，A组继续给予常规喂养；B组给予0.9%氯化钠溶液灌胃；C组给予中药太子参、黄芪、甘草熬制滤取浓度为0.50g/ml的煎液进行灌胃治疗；D组给予中药石斛、乌梅、炒白芍熬制滤取浓度为0.35g/ml的煎液进行灌胃治疗；E组给予中药半枝莲、蛇莓、蜥蜴、枳壳、三七粉熬制滤取浓度为0.47g/ml的煎液灌胃治疗；F组给予所有中药熬制滤取浓度为1.30g/ml的煎液灌胃治疗；G组用0.1g/ml维酶素混悬液灌胃治疗。以上各组灌胃，频率为2次/日，连续用药治疗12周。3.标本采集与制备在连续治疗12周之后，所有大鼠按照5ml/kg的10%水合氯醛溶液剂量，于腹腔内注射麻醉。将麻醉后的大鼠沿腹部切开，取出包括食管和十二指肠部分（各1.5cm）的整个胃部。沿胃大弯侧面将胃用手术剪剖开，先用生理盐水将胃内容物冲洗干净后，将整个胃铺开并用大头针固定于泡沫板上，然后置于4%甲醛溶液中浸泡12h。然后在食管、十二指肠、胃窦及胃大、小弯处各剪出大小约为0.3cm×1cm的条状胃组织，置于包埋盒内，进行梯度脱水和石蜡包埋。最后进行HE染色，并做免疫组织化学检测。4.指标检测的方法步骤4.1HE染色将胃体组织用塑料泡及大头针固定好，置于4%多聚甲醛溶液中浸泡12h，修材并置入包埋盒。然后将组织放入梯度酒精进行脱水，溶液为70%乙醇（2h）、80%乙醇（2h）、90%乙醇（2h）、95%乙醇（1h）、100%乙醇Ⅰ、Ⅱ（各20min）、二甲苯Ⅰ、Ⅱ（各20min）。用58℃石蜡浸蜡，蜡Ⅰ、Ⅱ（各90min），然后包埋组织。然后将组织蜡块用石蜡切片6 宁夏医科大学硕士学位论文材料与方法机切片，厚度为5μm。将组织切片平铺于48℃热水中展片，用载玻片捞片，并在切片空白处做好标记，于60℃摊烤片机烘烤15min烘干。将烘烤后的切片依次放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ（各10min）中脱蜡，梯度酒精复水100%乙醇Ⅰ、Ⅱ，95%乙醇，90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇（各10min）。浸洗3次，每次1min。后将切片放入苏木精溶液中染色10min，流水冲10min，盐酸酒精中返蓝（数秒），流水冲15min，然后置于伊红染色5min，自来水浸洗，由低至高的梯度酒精上行脱水各5min，再放入二甲苯Ⅰ到二甲苯Ⅱ各10min。取出载玻片，擦去组织周围的二甲苯，均匀滴加中性树胶，用盖玻片封固，晾干后，在显微镜下观察。4.2免疫组化显色如前方法固定胃体组织，并浸泡、修材。进行梯度酒精脱水。切厚度为5μm薄片，固定在载玻片上，放置于载玻架上，并入60℃温箱中烘干。随后将载玻片依次放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ（各10min）中脱蜡，梯度酒精复水100%乙醇Ⅰ、Ⅱ，95%乙醇，90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇中，以上各10min。随后进行抗原修复：清水浸洗，3%H2O2浸泡10min，清水浸洗2次，以消除内源性过氧化酶对抗原的影响。将倒好的柠檬酸缓冲液放入微波炉蒸煮至沸腾后，放入标记好的载玻片，中火蒸煮2次×3min，取出冷却至室温。清水冲洗2次，PBS溶液中浸洗3次×5min，拿出载玻片擦除周围PBS液，滴加山羊血清封闭，置37℃恒温箱中1小时。甩去血清，用吸水纸擦干，滴加一抗，阴性对照载玻片滴加PBS液，4℃冰箱保存过夜。第二天取出载玻片入37℃电热恒温箱中复温30min，PBS溶液中浸洗3次×5min，拿出载玻片擦除周围PBS液后滴加二抗，置37℃恒温箱中1小时。1小时后取出载玻片，PBS溶液中浸洗3次×5min，擦除载玻片周围PBS液后滴加显色剂，随后于清水冲洗，苏木精染色（30s），流水下冲洗10min，盐酸酒精中返蓝（数秒），流水冲洗15min后依次放入70%、80%、90%的酒精中分别浸泡30秒钟×1次，最后在95%、100%、100%的酒精中浸泡5分钟×1次脱水。最后将切片放入二甲苯浸泡透明5分钟×2次后中性树胶封片，通风柜中晾干，显微镜下观察。7 宁夏医科大学硕士学位论文材料与方法4.3观察指标及检测方法（1）一般情况：观察各组大鼠的活动度及存活率情况、精神状态是否良好、毛色有无光泽、饮水及进食量的多少、体重增减及大便的性状有无变化。（2）病理组织学观察：肉眼观察各组大鼠胃黏膜是否完整及光滑、色泽有无改变、皱襞有无变细、胃壁有无变薄、是否有糜烂、出血等病理组织学改变。切片行HE染色后，镜下观察各组大鼠胃黏膜腺体结构是否规则，是否有萎缩、IM及Dys等情况出现。（3）免疫组化染色：切片行免疫组化染色后，检测各组大鼠胃黏膜组织P53、PUMA因子的表达情况。镜下观察显示P53、PUMA的细胞核或（和）细胞浆中出现棕黄色颗粒即为阳性染色，并采用Image-ProPlus6.0图像分析系统，在每张切片上随机选取5个高倍视野，以测定P53、PUMA的阳性区域图像平均吸光度（AOD）。5.统计学分析收集资料整理数据，采用SPSS18.0统计软件对所得数据进行分析，计量资料用（X士S）表示，采用完全随机设计资料的单因素方差分析(One-WayANOVA)，组间的比较采用独立样本的t检验；多组间的比较采用LSD法对其进行均数间的两两比较。数据分析结果以P0.05为有统计学意义。8 宁夏医科大学硕士学位论文结果结果1.一般情况实验过程中，空白对照组大鼠体形较大，体重逐渐增加，行动灵敏，精神状态佳，皮毛柔顺且有光泽，进食进水量良好，大便呈颗粒状；模型对照组大鼠逐渐形体消瘦，活动较少，精神萎靡，被毛松散，饮食饮水量减少，大便软，不成形。各治疗组大鼠经过药物治疗后，上述表现均有明显改善，活动增多，进食逐渐恢复至正常状态，大便逐渐正常。2.大鼠体重变化各组大鼠平均体重变化见表1。表1治疗前后各组大鼠体重变化比较（X±S）给药前给药后组别n平均体重(g)平均体重(g)空白对照组8541.44±52.61639.25±54.16△)模型对照组6430.13±37.23538.37±28.58补气组8454.61±39.36△)608.25±26.26▲)养阴组8456.22±45.72△)577.71±38.57▲,▽,▼)解毒通络组7449.83±42.06△)561.36±49.16▲,▽)△)613.15±53.28▲,▽,▼)全方组8453.16±49.61△)567.27±49.34▲,▽)维酶素对照组7448.23±38.27△)注：给药前，各组与A组同期比较，P0.05；B、C、D、E、F、G组之间比较，数据无统计学▲)▽)意义P＞0.05；给药后，各治疗组与B组同期比较，P0.05；各治疗组与C组同期比较，P0.05；▼)D、F组与G组同期比较，P0.05.9 宁夏医科大学硕士学位论文结果3.实验大鼠胃黏膜病理组织学观察3.1肉眼观察空白组大鼠的胃黏膜完整，胃壁较厚，形态及色泽正常，黏膜呈粉红色，表面较光滑，黏液较多；模型对照组大鼠胃黏膜尚完整，胃壁较薄，缺乏光泽，黏膜呈灰白色，皱襞紊乱，有散在出血点及糜烂部位，表面欠光滑，胃壁弹力减弱，无黏液；各治疗组情况相比于模型组有一定的好转，其中补气组胃黏膜较完整，黏膜表明较平整荣润，部分黏膜脱落、变薄，黏膜下可透见血管，少见出血点。养阴组胃黏膜皱襞较规则，色泽稍偏灰白，可见黏膜有脱落，有散在出血点。解毒通络组大鼠胃黏膜皱襞较规则，稍欠光泽，部分黏膜变薄，少见出血点及糜烂点。维酶素对照组大鼠胃黏膜皱襞较为规则，色泽稍偏白色，黏膜变薄，有散在出血点及糜烂点。蜥蜴胃康基本方组大鼠胃黏膜皱襞较规则，少有黏膜皱襞紊乱的表现。3.2HE染色光镜下观察HE染色结果显示如下（见图1）：空白对照组大鼠胃黏膜上皮完整，皱襞形态正常，腺体排列整齐，形态规则，黏膜肌层较薄，有少量淋巴细胞，固有层未见炎性浸润，偶见粘液腺，无水肿、出血及糜烂等相关表现。模型对照组大鼠胃黏膜变薄，皱襞形态不规则，有胃黏膜有萎缩伴IM和Dys出现，黏膜上皮浅表糜烂，腺体排列紊乱，形态不规则，数目减少，细胞核变大并有较深的染色，核浆比值增大，大小不等、形状不同。补气组大鼠胃黏膜形态较完整，局部可见轻度IM及Dys，腺体排列较规则。养阴组大鼠胃黏膜结构较完整，腺体结构稍见紊乱、腺体轻到中度萎缩，局部有轻（中）度IM，可见血管增生。解毒通络组大鼠胃黏膜较完整，部分胃黏膜可见轻-中度萎缩，局部可见肠化上皮杯状细胞、异型增生，腺体排列及形态稍欠规则，并伴轻度萎缩。全方组大鼠胃黏膜形态较清晰，呈轻-中度萎缩伴轻度IM，可少见杯状细胞，腺体排列较整齐伴轻度萎缩，形态较规则，固有层有散在的淋巴细胞出现。维酶素组大鼠胃黏膜结构较为10 宁夏医科大学硕士学位论文结果完整，部分胃黏膜上皮可见有轻、中度IM及Dys；上皮腺体排列基本整齐，部分增生的腺体形态稍不规则，轻度萎缩伴结构紊乱。4.免疫组化统计结果4.1各组大鼠P53、PUMA蛋白的表达切片行免疫组化染色后，镜下观察P53、PUMA的阳性表达均在细胞核或（和）细胞浆中，显色为棕黄色（见表2-3及图2-3）。免疫组化染色结果显示：空白对照组P53未见表达，PUMA有大量的淡黄色阳性细胞表达；模型对照组P53可见大量棕色甚至黄褐色细胞，PUMA有少量表达；各治疗组细胞核或（和）细胞浆中P53的阳性表达均有不同程度降低，阳性细胞呈散在分布，深棕黄色强阳性细胞表达量较少，全方组的细胞中阳性表达率最低，染色最淡。PUMA的阳性表达有不同程度升高，其中以全方组的阳性表达率升高明显。经SPSS18.0统计软件分析P53、PUMA阳性表达数据后显示，模型对照组、补气组、养阴组、解毒通络组与空白对照组比较，P0.05；其中空白对照组中未检测出P53阳性表达。补气组、养阴组、解毒通络组与模型对照组比较，P0.05；补气组、养阴组、解毒通络组与全方组比较，P0.05，其中P53以全方组AOD值最低，而PUMA以全方组最高，均能够显示全方组的治疗效果最明显；各拆方治疗组之间比较，P0.05，其中P53以补气组AOD值最低，也说明了补气组的治疗效果最明显；各拆方治疗组与维酶素对照组相比较，P0.05。11 宁夏医科大学硕士学位论文结果表2治疗后各组大鼠胃黏膜P53的表达（X±S）组别nAOD值（A×10-2）空白对照组80模型对照组60.38±0.33▽补气组80.24±0.01°养阴组70.29±0.09°▽解毒通络组80.29±0.02°▽全方组80.23±0.01°维酶素对照组70.27±0.07注:各组与A组比较，差异有统计学意义，P0.05；各治疗组与B组比较，P0.05；各治疗▽组与F组比较：P0.05；C,D,E,F组与G组相比较，°P＜0.05；C,D,E与F组相比较，P＜0.05；C组与D，E组比较：P0.05.表3治疗后各组大鼠胃黏膜PUMA的表达（X±S）组别nAOD值（A×10-2）空白组对照80.36±0.03模型对照组60.19±0.06▽补气组80.31±0.03°养阴组70.30±0.02°▽解毒通络组80.27±0.01°▽全方组80.32±0.02°维酶素对照组70.23±0.02注:各组与A组比较，差异有统计学意义，P0.05；各治疗组与B组比较，P0.05；各治疗▽组与F组比较：P0.05；C,D,E,F组与G组相比较，°P＜0.05；C,D,E与F组相比较，P＜0.05；C组与D，E组比较：P0.05.12 宁夏医科大学硕士学位论文讨论讨论1.PLGC大鼠模型制备制备良好的动物模型能够弥补在人体疾病方面研究的不足，此次研究尽量在动物模型中再现PLGC的模型，能够更好地研究PLGC的发生机制及评价相关抗肿瘤药物的疗效。目前在动物选择方面，多选用大鼠、家兔等体型较小、价格低廉、模型容易制作且容易操作的实验动物来进行。相比于犬及猴类等体型较大的动物，大鼠饲养简单、成本较低，而且容易在较短时间内成功制备PLGC模型，因而本次实验选用大鼠为实验动物。常用的造模方法如下：1.反复损伤胃黏膜屏障。有研究[7]用胆汁及热水灌胃刺激，同时给大鼠皮下注射剂抗原，能够造成大鼠萎缩性胃炎，伴有肠化生甚至异型增生，以及使用免疫佐剂损伤胃黏膜等损伤胃黏膜的方法来构造动物模型。2.利用HP感染动物造模。李琦[8]等通过给小鼠经口直接灌服幽门螺旋杆菌标准株SS1，然后用HE染色法观察小鼠胃黏膜的病理变化，以及用免疫组化法观察小鼠胃黏膜微血管密度，发现25,45,72wk时,CAG,IM,Dys和胃癌的发生率分别为88.9%,77.8%,33.3%和22.2%，但对菌株的质量要求较高，且需对于灌胃菌量进行严格控制，操作较为复杂。3.采取从药物关木通中提取马兜铃酸来建立PLGC模型。李春英[9]等采用关木通乙醇提取物给大鼠灌胃来制备PLGC大鼠模型，观察各组胃组织形态学改变，发现在20周左右就可出现较高的癌变阳性率，但是该方法能造成小鼠肾脏损害。此外还有使用胃癌细胞株移植、人胃癌异种移植等方法，但都存在着比如对技术要求比较高，成本费用较高等问题。本次实验采取以大鼠为实验动物，采用某些致癌化合物损伤胃黏膜为主的综合模型制备方法来进行。该方法技术成熟，操作容易实现且成功率较高，具有很高的可行性。该方法主要使用胃癌诱导剂MNNG给大鼠自由、随意饮用，并结合酒精给予大鼠灌胃以建立PLGC动物模型，其方法应用率高，技术相对成熟，是国内外较为成熟的PLGC模型制作方法之一。13 宁夏医科大学硕士学位论文讨论MNNG是被近年来广泛使用的一种致癌剂，能直接作用于胃黏膜上皮，模拟硝酸盐在胃内被细菌转化为亚硝酸盐，经过一系列化学变化，最终成为亚硝酸胺等致癌物质，长期作用导致胃癌前病变乃至胃癌的发生。酒精也能直接作用于胃黏膜，刺激胃酸分泌，引起胃黏膜充血水肿，久而久之则能够引起胃体组织的损害。再配合饥饱失常（禁食饱食交替进行）的行为刺激，模拟不规律的饮食对胃黏膜的损害，更能够加快成模时间，提高成模的稳定性。该方法主要通过模拟产生具有高致癌性的亚硝酸胺类化合物，增加酒精含量以损伤胃黏膜，以及不规律饮食等三个胃癌的高危饮食习惯因素，来制造PLGC动物模型。这种综合的造模方法不仅更加符合实际临床当中PLGC及胃癌的发病原因和特征，使模型更具有可信性，而且与单一因素造模相比，能够相对地缩短造模时间，更利于实验的进行。2.PLGC的病因病机导师通过既往的实验和临床方面的研究工作，对PLGC的病机的认识有着自己的见解。导师认为，饮食因素、情志因素及外感湿热毒邪、“虫邪”，都能够导致PLGC的发生。过食肥甘厚腻、辛辣及高盐的食物，或饮酒不节，均可导致湿热内阻于中焦。《内经》：“饮食自倍，肠胃乃伤”。饮食不规律，饥饱失常，宿食不化，亦可久郁而化热，湿热内阻中焦，热病伤阴；或胃热日久，则能够耗伤胃中阴液，也可导致胃阴的缺乏，脉络失其濡养，可致胃脘部隐痛不适。郁怒则气上，而伤肝，肝气郁滞，结于中焦，日久则化火，火热灼伤胃阴，造成胃阴亏损；而气滞日久，亦可血液失其推动，血脉流通失畅，血脉凝涩，则瘀血内结；思则气结而伤脾，脾弱而肝旺，木贼而乘土，使胃腑受克，胃气不和，脾失健运，久之则成脾胃气阴两虚及瘀血内停之证。外感湿热毒邪侵袭入里，阻滞于中焦胃脘，胃气壅滞，而成痞满，胃气郁滞亦可导致胃胀痛不适。湿热疫毒入里，也可导致气血运行失其所畅，毒瘀交阻于络。14 宁夏医科大学硕士学位论文讨论久病则损及脾胃，损耗胃气，伤及胃阴，导致脾胃虚弱，胃失阴液之濡养，则胃隐隐作痛。《兰室秘藏·中满腹胀》：“脾胃久虚之人…则胀满”。脾胃失其纳运之功能，气机运行失常，胃气中阻，出现胸膈满闷不舒之症。脾胃虚弱则气血生化不足，胃黏膜失其濡养，黏膜下多有微循环障碍出现，血络瘀阻亦是形成肠化增生的关键所在。本病是由湿热毒邪侵袭、饮食失常、情志等多种因素所导致，病位在胃，与脾、与肝皆相关。因实致虚，或因虚致实，最终多发展为脾胃虚弱、气阴不足、毒瘀交阻为主的虚实关联证候，这也是PLGC的基本病机。3.蜥蜴胃康方组方分析PLGC基本病机以脾胃气阴不足、毒瘀交阻的虚实夹杂证候为主，在临床当中多出现胃痛灼热不舒，口干咽燥，嘈杂，反酸，纳差，嗳气，舌质红而少津，或者花剥舌，脉沉细等症状，应以益气养阴、解毒通络立法组方来治疗。鉴于此，导师以沈舒文教授经验方结合自己多年临床体会及实验研究，创立蜥蜴胃康基本方，在临床当中取得了良好疗效。蜥蜴胃康基本方主要由宁夏密点麻蜥、太子参、黄芪、甘草、石斛、半枝莲、蛇莓、炒白芍、三七粉、枳实、乌梅等中药组成。其中方中宁夏密点麻蜥和太子参为君药；黄芪、石斛、乌梅、白芍、蛇莓、半枝莲为臣药；三七，枳壳为佐药；甘草为使药。该方重在补气、养阴、解毒通络，标本皆顾，相辅相成。宁夏密点麻蜥，又作石龙子，味咸，寒，归心、肝经，早在《神农本草经》一书中就有关于该药的记载。麻蜥以干燥的全体入药，具有活血止痛、解毒、利尿、化痰散结、解痉等功效，能够消散胃脘之毒邪瘀阻脉络，又可改善胃腑气血亏损，故为君药。太子参、甘草和黄芪三味药物都有补益脾气的功效。太子参味甘，微苦，入心、脾、肺三经，性平而柔润，具有健脾气，补脾阴，润肺的功能，多用于脾胃气阴不足之症。太子参在全方中主补益脾胃之功，且用量较大，其意在补益中焦脾胃气机，以推动气机的正常运行，胃络中浊毒瘀血才能够被清除，是所谓“营卫气血太和，自无瘀滞”。黄芪性味甘温，有补益之效，入肺、脾、肾三经，质轻气薄，味道甘淡，是肺脾上中二焦15 宁夏医科大学硕士学位论文讨论阳分之药。黄芪能够固自汗，解肌热，亦可治虚喘，司开阖，乃补气之圣药。《珍珠囊》：“黄芪甘温纯阳，其用有五：补诸虚不足，一也；益元气，二也；壮脾胃，…”。黄芪配伍太子参，共奏补益脾气的功能，为臣药。张仲景在《金匮要略》指出：“人体五脏元真通畅，人即安和”，即表明人体阳气能够主导疾病的发生发展。其在小建中汤里加入单味药物黄芪，可用来增强其补益脾气的功能，因而能治疗各种虚寒性的胃痛等疾病。此外，黄芪也具有“长肌肉”的功效，对有糜烂的胃黏膜表面有促进其恢复愈合的作用。炒白芍、乌梅和石斛三味药物共助滋阴之力。其中炒白芍性味微苦寒，入肝、脾两经。略苦则能够补阴，微酸则能够收敛。能补能泻，调和气血。古人言其炒用则能够制去其性，收敛脾气之散，胃气之热。张元素认为，白芍能够入脾经，补中焦，得到炙甘草的佐助，能够很好地治疗腹中痛。在本方中，炒白芍能发挥补益脾胃气阴得作用，以除脾胃燥热，调理气机，清脾以升清。《本草害利》言白芍“同参芪补气，以助君药发挥其行气养血，滋阴通脉之效”。乌梅性平，味酸涩，归肝、脾、肺、大肠经，能够敛肺生阴、驱虫、止血、止痢、固脱。《本草求真》中言“乌梅，酸涩而温…故于久泻久痢…因其收涩之性”。乌梅作为臣药，发挥其滋阴、固涩之功，既使脾胃阴血得补，又能固涩胃络血脉防止其外泻。石斛性味甘寒，甘可悦脾，又可补益，咸能益肾，寒能清泻，甘多寒少，又归胃肾二经，多功于脾、肾之水土二脏。特别适合对胃肠疾病的治疗。该药在本方中，在于除去脾胃之火，清脾胃之湿热，以助君药；又能养阴除烦，配合白芍及乌梅，发挥其滋补胃肾之阴的功效。上三味，炒白芍养血敛阴，石斛滋阴益胃，乌梅生津柔肝，以助滋阴之力。蛇莓性味甘、苦寒，入肺、肝、大肠经，能够舒经活血、清热解毒、并能解蛇虫咬伤之毒，也能够治疗癌肿，具有多种功效。蛇莓配合君药宁夏密点麻蜥，以清脾胃湿热之邪，并消肿散结。此外，蛇莓还具有收敛止血的功效，能够减轻胃络瘀阻而引发的出血之症。半枝莲又名松叶牡丹，性味辛、苦寒，入肺、肝、肾经，多用于治疗各种痈疡之症，可破血通经，散瘀止血。《泉州本草》认为半枝莲具有清热、祛风、散血、通络、破瘀、解毒、止痛等功能。《常用草药治疗手册》也认为该药能够益气软坚，行气化瘀。方中半枝莲配合宁夏密点麻蜥，能够清脾胃湿热，清解胃络浊毒，以行血脉之瘀阻。16 宁夏医科大学硕士学位论文讨论枳壳性寒而味苦，乃枳实之大者。专主破至高之气，气顺则胸膈利，三焦通，浊邪并除。枳壳可宽利脾胃气机，消除食满。《珍珠囊》“破气，泄肺中不利之气”。此外枳壳还具有“健脾开胃，调五脏，下气”之功能。枳壳在全方中，除了行胃络之气滞，并有促瘀血之消散的功效。三七性味甘、微苦温，功专散血，又善止血，防止血液妄行，无论各部之出血，单用此味药就能奏效。本方之中多补益之品，三七得补药则能收敛其发散的特性，补药得三七之止则能安然地发挥其补益的效用。此外，三七也有有补虚强壮之力，能够治疗对于本病后期多见的虚弱之症。蛇莓、半枝莲清热解毒，枳壳理气行中，三七养血活血、散瘀止痛，毒瘀消散则微循环通畅，黏膜得养而修复，二者相辅相成。甘草为五味之长，众药之主。甘草独入脾胃，兼乎五脏，能补能泻，能和能缓，正所谓培植中州，养育四旁。《本草从新》：“味甘，生用气平，补脾胃不足…能协和诸药，使之不争”。调理脾胃，解痈肿诸毒，补三焦元气，缓正气，养阴血，坚筋骨，在方剂中常常发挥调和诸药药性之功。也可缓和苦寒之药对胃肠道的刺激。全方诸药合用，气阴双补，使得气血生化有源，毒瘀也能够得到消散。4.蜥蜴胃康方现代药理研究蜥蜴胃康基本方中宁夏密点麻蜥，含有蛋白质、氨基酸及多种微量元素等。宁夏密点麻蜥能够增强机体免疫[10]，并通过抑制胃泌素的分泌，从而降低胃酸的分泌，以达到抗溃疡和保护胃黏膜屏障的作用[11]。在PLGC的治疗方面，研究显示[12-14]，以宁夏密点麻蜥为主组成的复方蜥蜴散能够抑制组织中IKKβ的表达，提高胃黏膜Bax蛋白表达，调节肿瘤坏死因子、降低Bcl-2、Stat3的表达等，对PLGC的发病进行有效的干预。太子参根含太子参多糖PHP-A、太子参环肽、组氨酸等8种氨基酸，各种挥发油类，以及胡萝卜苷、太子参皂甙A等苷类成分。苷类成分对机体免疫具有促进作用，太子参皂苷能够抗脂质过氧化活性的能力有关[15]。而糖类成分，如太子参多糖能够显著增强小鼠抗疲劳和抗氧化等方面的功能，也能够增加小鼠免疫器官的重量。蔡巧燕[16]等研究认为：太子参氯仿、石油醚部位等成分能够对三种癌细胞RKO、HepG2和17 宁夏医科大学硕士学位论文讨论MGC80-3进行有效抑制。此外，太子参中的氨基酸也能够增强机体免疫外界刺激的作用。甘草具有降低胃酸浓度、抑制胃溃疡等作用。其主要成分有三萜类和黄酮类化合物。三萜类化合物如甘草酸、甘草次酸，黄酮类有异甘草素、甘草多糖及甘草黄酮等[17]。韩龙哲[18]等通过研究总黄酮及甘草查尔酮A后发现，总黄酮成分能够对3种癌细胞H1792、Calu-1、A549的生长进行有效的控制，查尔酮A在高浓度下能够抑制H1792、Calu-1的生长。孟艳秋[19]等通过SRB法对甘草次酸进行研究发现，该化合物5a、5c、5e能够抑制肿瘤细胞MCF-7及A549生长。甘草次酸能够抑制胃癌细胞BCG823的生长，使其停滞在细胞分化期，具有独特的抗肿瘤作用。此外，甘草次酸也具有良好的抗炎及抗溃疡作用，它能够抑制皮下肉芽肿性的炎症，抑制小鼠的耳肿胀等炎症性疾病。王志强[20]等通过实验发现异甘草素能清除HMEC-1细胞内的ROS生成，从而抑制HMEC-1细胞血管生成，诱导细胞凋亡。甘草的另外一种有效成分是甘草酸，甘草酸能够增强T细胞的活性，也能够增强肝NK细胞得杀伤力，具有促进免疫系统的作用。此外，甘草酸也能够保护PLGC过程中的DNA损伤，从而抑制PLGC的发生。黄芪的主要有效成分黄芪多糖，能够抗病毒，抑制肿瘤转移以及诱导肿瘤细胞凋亡，并能显著提高细胞与体液免疫功能[21]，可以促进T淋巴细胞以分裂的方式产生新的细胞，从而达到扶正祛邪的目的。黄芪多糖在PLGC免疫系统调控、促进抗癌细胞素分泌中有积极作用，目前黄芪多糖在治疗胃癌当中有较多应用[22-23]。黄芪多糖能增强小鼠细胞及体液免疫，也能够增强其巨噬细胞的吞噬功能。有研究表明，黄芪多糖能够下调PLGC大鼠P53、P65、VEGF的蛋白表达[24]。此外，张冬青等[25]通过研究认为不同浓度黄芪总黄酮能够阻滞K562细胞的生长周期，降低细胞内CyclinD1mRNA水平从而抑制K562细胞的增殖。黄芪多糖能够抑制胃癌细胞株MKN45以及MKN28的增殖，阻滞细胞MKN45于G1期。此外，黄芪多糖还具有抗菌及抗炎的作用，能够增强肠黏膜的屏障功能，减少细菌进入肠黏膜的上皮细胞。白芍主要具有抗抑郁、改善睡眠、抗炎、抗肿瘤、调节机体免疫等作用，其主要成18 宁夏医科大学硕士学位论文讨论分为白芍总苷、三萜和黄酮类化合物，以及3个具有免疫活性的多糖。白芍总苷脂质体可能通过提高荷瘤机体的免疫，从而提高抗肿瘤活性[26]。也有研究表明[27]，白芍总苷抗肿瘤机制可能是其脂质体与下调Bcl2蛋白表达、上调Bax蛋白表达相关。覃雪峰等[28]通过CCK-8法测定白芍总苷脂质体对以BEL-7402、HCT116等人癌细胞株增殖的影响，发现白芍总苷能够有效抑制癌细胞的增殖，显著延长荷瘤小鼠的生存时间。白芍苷R1能够对胃癌细胞株K562的增殖进行了抑制，其抑制率为35.1%，体现了白芍苷R1的抗癌活性。此外，白芍总苷具有显著的抗炎作用，可明显减轻二甲苯所致小鼠炎症的所表现出的扭体次数，也可以通过降低血清IL-6等含量，减轻大鼠结肠炎的损伤。低浓度的白芍总苷能诱导小鼠脾淋巴细胞的增殖，也能反映出白芍所具有的免疫调节作用。石斛的化学成分有大黄酚、柏泪醇、以及石斛碱、羟基石斛碱等生物碱类成分。石斛具有解热、调节免疫功能、增进胃肠蠕动、抗肿瘤、降血糖等的作用[29]。石斛的有效抗肿瘤成分为石斛多糖[30]，石斛多糖能够提高细胞免疫，促进肝细胞中白细胞介素4的分泌和增加体外培养小鼠的脾、小肠细胞的增殖[31]。刘春叶等通过石斛养胃汤对慢性萎缩性胃炎患者进行治疗发现，其总有效率为88.24%，认为石斛养胃汤对慢性萎缩性胃炎有一定的治疗的作用[32]。金钗石斛多糖能够对肿瘤细胞株HL60及A549有细胞毒作用，也能够诱导K562细胞的凋亡。与此同时，鼓槌石斛也能够抑制肿瘤细胞株K562的增殖，石斛能促进小鼠巨噬细胞的吞噬功能，起到增强免疫的作用。乌梅具有80多种挥发性化合物，黄酮苷类、糖类以及柠檬酸和苹果酸等有机酸成分，甘油三酯等脂类成分等。现代药理研究显示，乌梅具有抗病原微生物，抗过敏，抗氧化，抗肿瘤等多种功能[33]。有研究发现[34]，乌梅能够提高机体免疫，缩小小鼠皮下移植肉瘤体积，减轻肿瘤恶化程度。乌梅能够抑制细胞DNA合成，使其停滞于G2/M期。王萍[35]等通过计算原位移植瘤模型小鼠瘤重、抑瘤率及肺癌转移灶数，发现乌梅丸及其拆方在一定程度能够抑制小鼠乳腺癌的增殖。在抗病原微生物方面，乌梅能够有效抑制金黄色葡萄球菌的生长，也对于沙门菌比较敏感，具有抑制其生长的作用。蛇莓主要具有抗肿瘤、抗氧化、抗病原微生物等作用[36]，其有效成为蛇莓总酚。蛇莓提取物可能与促进表达Bax蛋白的表达，并抑制Bcl-2蛋白的表达有关[37]，也有研究表19 宁夏医科大学硕士学位论文讨论明：蛇莓水提取物能够抑制小鼠移植瘤S180的生长[38]，从而达到阻滞肿瘤生长的目的。其抗肿瘤的机制也包括通过提高机体细胞与免疫应答的水平来发挥体内抗肿瘤的功效[39]。彭博[40]等通过检测U14移植瘤模型小鼠肿瘤抑制率、T淋巴细胞转化率和B淋巴细胞抗体量，结果发现能够提高荷瘤鼠的细胞及体液免疫应答。半枝莲的主要活性成分是野黄芩苷、半枝莲二萜、半枝莲多糖及挥发油等物质，药理活性主要包括解热与免疫增强[41]、抑制肿瘤生长、调节药物代谢酶、抗氧化等。野黄芩苷能够抑制炎症过程中的渗出及肿胀等现象，也能够抑制大鼠的肉芽增生，具有独特的抗炎及提高机体免疫的作用。黄酮类化合物能够增强免疫活性和抑制肿瘤活性[42]。也有研究认为，半枝莲抗肿瘤的机制与阻断内皮细胞的转移，从而有效抑制肿瘤血管生成有关[43]。半枝莲水提取物能够提高机体免疫，提高NK细胞的活性，增强淋巴细胞的增殖，这也是中药抗肿瘤的重要方面之一。而陈爱东[44]等通过研究发现，中剂量的半枝莲多糖能明显地抑制肿瘤生长，这种功能的实现可能与其能够促进抑癌基因P21的表达有关。此外，半枝莲多糖能提高外周血血清的IL-2水平，从而能够抑制小鼠的S180肉瘤生长。枳壳内主要含有橙皮苷、柚皮苷、野漆树苷等黄酮苷类成分，以及含有挥发油、生物碱及铁、锌、铜等少量微量元素物质。其所含川陈皮素能够抑制Caco-2、HeLa、HepG2、A375、SW1990等5种肿瘤细胞的生长[45]。此外，川陈皮素还能够诱导细胞凋亡，对癌细胞A549有抑制其增殖的作用。枳壳对于调节胃肠运动的功能主要体现在其所含川陈皮素能够明显地抑制胃肠道平滑肌的收缩，使其收缩幅度大幅度地减少。枳壳中所含柠檬烯也能够抑制胃癌细胞SG-7901的活性[46]。枳壳也能够抑制平滑肌，解除肠痉挛。枳壳的水煎液能促进小鼠的胃肠蠕动及推进，抑制平滑肌及促进胃肠功能都有可能是枳壳所含有的大量发挥油所实现的。三七含有三七皂苷、黄酮、氨基酸、以及三七素等物质。其中三七总皂苷能够诱导癌细胞分化、逆转肿瘤细胞耐药，也能够杀伤肿瘤细胞[47]。三七茎叶总皂苷酶转化产物和人参皂苷化合物K也能够有效抗肿瘤[48]。此外三七可抑制胃黏膜上皮细胞的生长，增加G[49]2/M期的大鼠巨噬细胞。三七的抗炎功效，主要是能够抑制血管通透性，且能20 宁夏医科大学硕士学位论文讨论够升高血浆皮质醇浓度有关。三七总皂苷能够有效改善大鼠关节炎症，也能够治疗关节炎。三七总皂苷能调控壁细胞分泌胃酸，能够实现抗溃疡的作用，对胃溃疡有明显的保护作用。5.P53、PUMA与PLGC的关系PLGC的发生，是多种致病因素及多种基因相互协同而产生的，而抑癌基因的失活也主要参与肠型胃癌的发生发展。P53作为一种抑癌基因，激活后能导致细胞的凋亡，在PLGC中经常有异常的表达。P53基因是人体抑癌基因。P53全长2074bp，非翻译区由881个核苷酸组成，编码区由1179个核苷酸组成。当染色体发生损伤，端粒序列丢失，这种丢失到一定程度，则能够激活P53，使其发挥作用，诱导细胞周期G1期阻断而凋亡，以及保护基因组的完整性等作用。野生型P53并不稳定，其半衰期只有15~30min，在正常细胞中很难被检测到。因此可以说P53野生型蛋白是一种重要的抗癌基因，能够防止癌变，除此外还具有帮助癌细胞基因修复缺陷的功能。在DNA受到损伤时，诱导细胞修复DNA而停滞于G1期。该型P53在基因受到损伤后大量表达，对轻度DNA损伤进行修复，若损伤较重则诱导细胞凋亡。而该基因发生突变则能够使得肿瘤发生。虽然野生型P53蛋白分子能够抑制肿瘤，但其突变型的等位基因却能够使细胞发生恶性转化。这种突变型的P53蛋白与野生型P53结合产生了异寡聚体复合物，从而使得P53蛋白分子不能跟DNA相结合。这种P53基因突变有多种类型，如错义突变、基因重排、等位基因丢失等。P53基因在肿瘤中突变率较高，超过一半的肿瘤中均存在，在胃癌中甚至达到32%[50]。在散发型实体瘤中,P53突变检出率为20%-60%[51]。突变型的蛋白构型发生改变，从而产生P53蛋白集聚，可以用IHC法检测得到。突变型P53蛋白能够干扰野生型P53发挥作用，导致肿瘤发生[52]。P53通过多种信号途径实现对肿瘤的抑制作用，参与的信号分子多能够促进细胞的凋亡和快速老化，大约60%以上的肿瘤有P53基因的异常。目前P53的检测能够作为评估胃癌的参考指标，刘伟[53]等通过采用IHC方法检测775例胃腺癌标本中P53蛋白21 宁夏医科大学硕士学位论文讨论表达，发现其阳性表达率为46.84%。PUMA是野生型P53下游的靶基因，通常在BS-2结合位点与P53结合，以增加自身的转录。PUMA共有4个外显子，属于Bcl-2家族，但只有一个BH3结构域，所以PUMA的作用得以发挥，必须与该家族其他蛋白结合，需要Bax或者Bak的存在。Bax是PUMA蛋白下游的一个靶分子，若是某一个癌细胞中没有Bax基因，则该癌细胞能够抵制PUMA的表达。PUMA与Bcl-2家族结合后，使其释放凋亡蛋白，以诱导线粒体功能障碍，释放出促凋亡线粒体蛋白，进而导致细胞凋亡。野生型P53基因能够阻断癌细胞的增长，抑制肿瘤细胞的凋亡，但是这种功能的实现，也是需要PUMA基因参与才能实现的。各种毒性应激能够上调P53的转录，也必须通过下游PUMA的激活才能导致细胞的凋亡。如果P53正常而PUMA突变或者缺失，则不会出现细胞凋亡的情况。因此可以说，PUMA在P53发挥作用过程中是必不可少的。此外，在很多种情况下，PUMA也可以通过不依赖P53的途径来导致细胞的凋亡。比如PUMA在受到内质网的应激、缺血再灌注损伤的应激、感染或者免疫调节等应激的情况下，都能够诱导细胞凋亡。许多研究证实PUMA蛋白在肿瘤形成及治疗，多种细胞的凋亡过程中发挥了不可或缺的作用[54]。PUMA的失活或者突变，都有增加肿瘤发生的几率。而且肿瘤发生后，肿瘤细胞能够通过抗凋亡因子抵制PUMA的诱导肿瘤细胞的凋亡作用。PUMA可在胃癌及PLGC的诊断治疗当中发挥巨大的作用。刘勇[55]等通过IHC法对胃癌组织标本及正常标本的PUMA蛋白的表达进行测定，发现PUMA蛋白在胃癌组织中的阳性率大约为22.5%，而在正常胃组织中表达为66.7%，认为PUMA会成为胃癌的分子标记物，更加有利于胃癌及PLGC的早期诊断。而陈茗[56]应用SABC法检测胃黏膜病变，通过检测90例不同的病变组织中PUMA蛋白的表达，发现PUMA蛋白在IM及Dys的阳性率为53.00%,33.33%，认为PUMA蛋白在胃癌中的低表达提示胃癌的发生过程与细胞凋亡有关，也有助于胃癌的鉴别诊断。在关于肿瘤的治疗方面，PUMA基因能够直接参与到化疗药物对肿瘤治疗的过程当中。PUMA表达的增高，都能够提高药物的治疗效果，从而对癌细胞进行杀伤。陈22 宁夏医科大学硕士学位论文讨论燕[57]等先通过PUMA感染jeg-3/vp16细胞后化疗，发现PUMA上调能够增加细胞对化疗药物的敏感性。因此我们可以也认为PUMA可作为治疗胃癌乃至肿瘤的靶点，有广阔的前景。6.蜥蜴胃康基本方及其拆方对PLGC模型大鼠P53、PUMA的影响在PLGC模型对照组中，突变型P53阳性表达率高，与正常对照组的AOD值相比，P0.05，提示突变型P53可能通过促进细胞的大量增殖，抑制细胞凋亡，使得腺体结构改变，促进PLGC的发生；而PUMA的阳性表达率降低，可能是其上游基因P53发生突变，而抑制了PUMA的表达，PUMA的促凋亡功能受到抑制，则能够导致细胞增殖。各治疗组与空白对照组比较，P0.05；各治疗组与模型对照组比较，P0.05，而且全方组的AOD值最低，说明以益气养阴，解毒通络立法在治疗PLGC中能够取得较好的治疗效果；各拆方组比较，P0.05，其中以补气组AOD值最低，说明胃气充足，气血生化有源，增强机体抵抗力，保护胃黏膜。本实验研究结果提示，蜥蜴胃康基本方及其拆方可能是通过影响P53、PUMA的表达，诱导细胞发生凋亡，从而达到治疗PLGC的目的。23 宁夏医科大学硕士学位论文结论结论1.蜥蜴胃康基本方及其拆方能够改善PLGC模型大鼠体重变化，活动及存活情况、精神状态、毛色、饮食量、大便情况等一般情况。2.蜥蜴胃康基本方及其拆方能够改善PLGC模型大鼠胃黏膜腺体的萎缩、肠上皮化生及异型增生情况。3.蜥蜴胃康基本方及其拆方可以促进PUMA表达，并抑制突变型P53的高表达。4.本实验研究结果提示，蜥蜴胃康基本方对于气阴两虚，毒瘀交阻型的PLGC能够改善胃黏膜的Dys及IM状态，其中全方组对修复胃黏膜损伤优于各拆方组，而各组拆方组之间相比较，补气组对胃黏膜损伤的修复作用较养阴组和解毒通络组强，其机制可能是通过上调PUMA表达，并抑制突变型P53的高表达，从而实现干预PLGC和延缓癌变进程，增强机体免疫力，促进胃黏膜修复等作用。24 宁夏医科大学硕士学位论文附图附图图1各组大鼠胃黏膜组织病理形态学改变HE×100A空白对照组B模型对照组C补气组D养阴组E解毒通络组F全方组G维酶素对照组25 宁夏医科大学硕士学位论文附图图2各组大鼠胃黏膜组织P53免疫组化染色情况SP×200A空白对照组B模型对照组C补气组D养阴组E解毒通络组F全方组G维酶素对照组26 宁夏医科大学硕士学位论文附图图3各组大鼠胃黏膜组织PUMA免疫组化染色情况SP×200A空白对照组B模型对照组C补气组D养阴组E解毒通络组F全方组G维酶素对照组27 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宁夏医科大学硕士学位论文文献综述文献综述胃癌前病变诊治的现代研究进展胃癌前病变（precancerouslesionofgastriccancer,PLGC）是一个病理性概念，包括肠上皮化生（intestinalmetaplasia,IM）和异形增生（dysplasia,Dys），据报道[2]，全球每年新发胃癌病例约40万例，占所有新发癌症发病例数的5%。PLGC的癌变倾向明显[1]，阻止PLGC发生癌变，能够显著降低胃癌的发病率和死亡率，具有十分重要的意义。本文就近些年来关于PLGC的诊治情况概况作以综述。1.PLGC的诊断研究1.1肿瘤标志物诊断在PLGC的研究肿瘤标志物（TM）并不是或者说是很少由正常组织所产生，TM主要是由癌细胞分泌所产生，是机体对新生事物的一种反应，因而产生或升高了某些物质，如激素类、酶类、癌胚抗原类产物等，总共有六大类。这些物质通常从患者的血液、组织液、分泌液或组织中表达出来。其中敏感性高、特异性强的胃癌标志物如PG，MG-7,CA72-4的诊断价值较高，能够为临床上胃癌及PLGC诊断提供重要参考价值。胃蛋白酶原（PG）是由375个氨基酸所构成，主要分为血清胃蛋白酶原Ⅰ和Ⅱ。PGⅠ是由主细胞以及颈粘液细胞合成，而血清胃蛋白酶原Ⅱ的合成除了以上两种细胞外还有胃窦细胞以及Brunner腺合成。此外，PGⅡ也是胃黏膜分化成熟的标志。当发生胃癌前病变时，PGⅠ分泌会降低，PGⅠ和PGⅡ的比值也会发生改变，这在胃癌早期以及PLGC的诊断及筛查中有重要的意义。何玉善等[3]通过对100例CAG患者分对照组(48例)和CAG组(52例),以免疫放射和放射免疫法检测血清PGⅠ、PGⅡ和G-17水平。结果发现CAG组PGⅠ、与PGⅠ/PGⅡ相比于对照组，降低明显。因而可认为血清PGⅠ/PGⅡ及PGR检测能够反映出胃酸分泌的情况。张志镒等[4]通过检测胃癌及其PLGC高33 宁夏医科大学硕士学位论文文献综述危人群的血清PG水平,对比分析血清PGⅠ、PGⅡ以及PGⅠ/PGⅡ的值，结合内镜活检对比后认为，PG测定筛查胃癌及PLGC的结果可靠。人胃癌相关抗原（MG-7Ag）是属糖蛋白抗原，是用人胃癌单克隆抗体发现的，有较高的特异度，与胃黏膜Dys密切。具备肿瘤标志物的诊断监测及作用。陈建婷等[5]通过对131例血清MG7-Ag检测，发现其表达水平越高，胃癌的分化程度越低，二者呈负相关。因此认为MG7-Ag能够提高胃癌早期诊断水平。吴谨等[6]通过SP免疫组化检测125例胃黏膜活检组织的MG7-Ag的表达，以及通过ELISA法检测血清MG7-Ag含量，发现MG7-Ag在胃疾病的动态表达，发现该抗原的表达与细胞恶变程度具有一定的相关性。血清癌抗原CA72-4是一种粘蛋白，主要在人体的胚胎组织、胃、胰腺等部位存在，是胃癌及PLGC的可靠标记物。CA72-4在正常人血清中的含量较低，当发生各种消化道肿瘤时，CA72-4可能会异常地升高，通常会高于6U/mL，约有42%的胃癌患者的糖链抗原72-4升高。黄艳春等[7]通过对萎缩性胃炎伴Dys，伴IM患者各30例，以及30例正常胃黏膜采用双抗体夹心法对比分析发现胃液CA72-4进行检测发现其灵敏度为69.27%，特异度为70.32%。可认为CA72-4能够反映出胃黏膜对于PLGC的相关程度。CA19-9是一种糖蛋白成分，主要在粘蛋白上表达，在胃肠道恶性肿瘤中多出现异常增高。有研究认为[8]，该抗原在胃癌中的特异性为81.67%，敏感性为33.33%，而在正常人血清中难以检测得到。CA50通常在细胞发生恶性变时，糖基化酶被激活，则能够导致糖基结构改变，而成为CA50标志物。经研究发现，其在胃癌中敏感性为26.66%，特异性为83.33%[8]。1.2内镜诊断在PLGC的研究经胃镜检查胃黏膜并对异常部位取检能是诊断PLGC最直观的，最准确的方法之一，能够直接观察到病灶的大小、位置，也能够取得病理组织做活检，大大提高了疾病的阳性率，也能够明显地改善胃癌等疾病的治疗。目前来说，内镜诊断再加上病理活检，二者的结合是最可靠的诊断以及治疗的方法。34 宁夏医科大学硕士学位论文文献综述激光共聚焦显微内镜（laserscanningconfocalmicroendoscopy,LSCM）是在传统内镜基础上增加了共聚焦显微镜，该显微镜能够将整块组织放大一千倍，对细胞进行有效的观察。LSCM能够很明确地分辨IM、Dys以及上皮血管改变，能更好地检出PLGC及早期胃癌，准确率均在90%以上。染色内镜技术是在传统内镜下，使用色素制剂来染色，使得病灶的显现更加清晰，能够判断癌变区域，区分良恶性病变的不同，提高病变的检出率。夏阳[9]通过对212例早期胃癌及PLGC患者行电子染色内镜及普通内镜诊断发现电子染色内镜对Dys诊断准确率为100%,对早期胃癌检测准确率为94.7%。染色内镜技术结合电子放大内镜，能准确识别胃黏膜腺管开口及微细血管的某些改变，对早期胃癌及PLGC能够实现早期诊断。窄带成像内镜（NBI）属于电子染色内镜范畴，由于正常组织与病变组织吸收和散射特殊光带有着一定的差异，而NBI利用这种差异显示出黏膜表面不同组织的细小变化。加上放大内镜技术，能够清晰地显示胃黏膜早期的微小病变，以及初步判断胃黏膜病变的病理组织类型。王强等[10]对58例慢性炎症患者经该方法，确诊早期食管癌、食管炎等病例。周颖等[11]通过对120例萎缩性胃炎伴IM患者进行分组比较发现，NBI能明显检测出浅蓝色塉状结构，从而能确诊IM样改变。智能电子分光技术（FICE）可根据病变组织的不同，通过设定不同颜色的光组合而设定波长，以选择不同的图像，该技术主要是对普通胃镜捕捉的图像进行处理，使其更容易观察到消化道黏膜表面的细微血管及腺管的形态。根据血管纹理能推测肿瘤的具体情况，有利于早期癌症的检出。李庆新等[12]通过对将CAG及胃癌患者形FICE内镜检查，对比发现其阳性检出率高达90%以上，明显好于白光内镜60%的检出率。自体荧光内镜（AFI）也是利用正常组织与肿瘤组织的的差异，然后通过蓝色光和绿色光来辨别不同的组织类型，增强对肿瘤的识别能力。目前来说，AFI对早期胃癌及PLGC的诊断率能够达到90%以上。胃镜激光激发的方法就是利用荧光原理，在胃癌的部位能够发出黄绿色的荧光，而Dys部位多红紫色的荧光，可以和常发出绿色荧光的正常黏膜相区分。该方法能够更好地寻找病变部位，而且活检部分也可以做荧光光谱的分35 宁夏医科大学硕士学位论文文献综述析。叶衍铭等[13]对200例消化道癌症患者进行AFI检测,发现其诊断准确率为94.0%。而戈之铮等[14]对疑似消化道恶性肿瘤以及PLGC患者的170例离体手术标本和30例在体受试者进行AFI检查发现：AFI诊断总体准确性、阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV)分别为94.0%、92.6%和95.3%。现在AFI技术已经成为PLGC诊断的重要依据。2.PLGC治疗研究2.1根除Hp感染Hp感染是造成多种上消化道疾病的原因之一。1995年Fontham研究报道显示，Hp与萎缩和化生呈正相关。目前来说，Hp感染是已经确认的胃癌Ⅰ类致癌原，在我国人群感染率达到50%以上[15]。宗湘裕[16]等对106例确诊的慢性萎缩性胃炎患者进行Hp检测发现:单纯萎缩患者65例，Hp感染阳性32例（49%）；萎缩伴IM患者29例，其中Hp感染阳性21例（72%）；萎缩伴Dys患者12例，其中Hp感染阳性9例（75%）。Hp本身具有多种的毒力因子，比如Hp空炮毒素能够抑制T淋巴细胞，影响机体的免疫反应。而外膜蛋白则具有毒素，Hp能够导致胃黏膜的炎症，尤其是慢性的炎症能够导致细胞的凋亡，也能够促进细胞的增殖，这种增殖是由于其他组织代偿性的反应，而增殖的细胞则会具有突变的风险。此外，炎症也能够减弱机体自身的DNA修复能力。因此来说，根除Hp是对PLGC的重要组成部分。目前临床应用的根除Hp联合治疗方案主要有标准三联疗法及二、三线疗法，以及伴同、序贯等疗法。三联疗法以质子泵抑制剂、铋剂或橼酸铋中的一种或两种加克拉霉素为主。何晨熙[17]通过对240例Hp感染者分组观察，分别进行治疗，三联组，复方嗜酸乳杆菌片组及S.Boulardii组对Hp根除率，分别为64.1%（50/78）、79.2%（61/77）、85.9%（67/78）。Hp耐药成为三联疗法根除率降低的重要原因，因此四联疗法作为根除Hp的补救治疗方案。牟方宏[18]等提出运用四联疗法治疗Hp感染，该疗法发现由阿莫西林、克拉霉素、兰索拉唑及枸橼酸铋钾对Hp感染根除率为93.8%，而将的阿莫西林换为甲硝唑，其他36 宁夏医科大学硕士学位论文文献综述三种药物不变，则对Hp感染根除率为90.0%，且耐受性好，减少不良反应发生率，认为其可作为临床使用的治疗方案。为了克服克拉霉素及甲硝唑的耐药性，Maastricht共识提出了序贯疗法。将治疗时间定为10日，前5日使用阿莫西林和质子泵抑制剂，而后5日将阿莫西林换为甲硝唑和克拉霉素继续治疗。而杨熹[19]用通过60例Hp感染患者,随机分为两组进行治疗，结果发现由阿莫西林、克拉霉素、埃索美拉唑、左氧氟沙星所组成的10天序贯疗法治疗Hp感染，发现其对于Hp感染根除率达到93.33%，临床疗效佳，并认为该疗法具有不良反应低、根除率高等特点。2.2化学药物治疗化学药物对PLGC的治疗主要是逆转癌细胞的分化，使其转为正常，而组织其癌变。治疗的重点是对癌症的预防，其主要是分子的靶向治疗。COX-2在正常组织中几乎没有表达，而在PLGC及胃癌中的表达较高，曹清[20]等通过研究发现COX-2在导管原位癌组织阳性率51.85%。COX-2主要通过PGE2参与了肿瘤的生长，并可能通过E-钙黏素来加快了肿瘤的转移。因此对于COX-2的预防也是对PLGC的预防的重要方面。有研究表明[21]塞来昔布能够增加胃癌细胞BCG-823的P21表达，从而抑制癌细胞的生长。2.3PLGC的内镜下治疗内镜下黏膜切除术(EMR)是给给黏膜下层注入生理盐水，使病灶局部隆起，再用圈套器套住实施高频电切除。该方法多适用于可见的，小于2厘米的黏膜内癌。刘志坚等[22]通过EMR对病灶直径均在2厘米以下的隆起性腺瘤、早期胃癌及Dys成功地行黏膜切除术。徐国良等[23]报道通过行EMR治疗49例消化道早期胃癌及PLGC，取得了较好的效果。内镜黏膜下剥离术(ESD)能够扩大PLGC及早期胃癌的适应症，是在充分利用了EMR的优势，在其基础上上发展起来的对于早期胃癌胃镜下切除的新的方法。该方法在EMR基础上使用高频电刀及其他辅助设备进行剥离，可完整切除较大病灶、提供完37 宁夏医科大学硕士学位论文文献综述整病理诊断材料及预防复发。ESD可以一次性地将较大面积病变组织整个切除，能够很大程度上减少肿瘤的复发。刘靖正等[24]对127例上皮内瘤变患者及26例早期胃癌患者行ESD治疗，其组织学治愈率为94.8%。2.4中医药对于PLGC的治疗自先秦时代开始，两千多年以来，中医药在防治肿瘤中积累了丰富的理论知识和实际经验。《内经》认为肿瘤的形成是“喜怒不适…寒温不对”。《仁斋直指方》描绘肿瘤形态为“颗颗累垂”。《伤寒杂病论》也留下了许多目前仍然用以治疗肿瘤的方剂，如桂枝茯苓丸、大黄蛰虫丸等。中医药依靠其整体观念的指导及辨证论治的应用，以及毒副作用小等特点，在PLGC的临床防治中具备优势。也是治疗PLGC的重要组成部分。现代许多研究表明，单味中药对PLGC有很好的治疗作用，而且很多中药本身就具有抗肿瘤的作用，如甘草、高良姜、黄芪、白花蛇舌草等。赵宝利[25]通过对64例PLGC患者进行西药治疗和黄芪治疗,对两组临床疗效和复发率进行观察和比较发现黄芪治疗疗效显著，复发率低。针药并用、单纯针刺疗法、艾灸、推拿、捏脊穴位注射、敷贴及埋线等方法对PLGC也有较好疗效。赵国岑[26]认为CAG总属脾虚胃弱所致。取主穴脾俞、胃俞、中脘、内庭等益气健脾，并采用俞募配穴法缓解患者病痛，配合中药治疗本病已取得较好疗效。研究表明，中药复方能促进胃黏膜IM、Dys等胃癌前病变逆转。李佃贵[27]等采用化浊解毒方治疗胃癌前病变患者119例，经过治疗后总有效率为68.1%。李卫强[28]等采用复方蜥蜴散用于60例PLGC患者的治疗，发现其总有效率达到90%。范剑薇[29]等使用加味柴芍六君方来治疗58例PLGC肝郁脾虚型的患者，发现该方能够有效缓解患者的相关症状，在胃镜下观察，IM和Dys均有所减轻。刘涛[30]等使用胃康宁治疗CAG伴有IM或Dys患者45例，发现其有效率在90%以上，且能够有效改善患者的相关症状，降低COX-2蛋白表达以及逆转胃黏膜的IM。陈丽凤[31]对30例PLGC患者使用胃萎方来治疗，结果发现该方能有效干预胃癌前期病变，具有良好的临床疗效。38 宁夏医科大学硕士学位论文文献综述3.问题与展望虽然我们在PLGC的发病原因、诊治等几个方面的研究取得了不错的成就，但目前来说仍存在不少问题。如化学药物治疗疗效报道不一,周期较长，副作用较大；内镜下的治疗难度较高，并且有出血及穿孔等风险，各种内镜技术对人员及资金要求较高，难以普及推广；中医药在治疗PLGC方面存在疗效标准不统一、有效制剂相对较少、缺乏高质量的对照研究方法、不科学的统计方法以及不合理的科研设计等问题。总体而言，PLGC的诊治尚缺乏有效地诊治技术和方法。在以后的研究中，需要进行大样本量规范的随机化临床双盲对照研究，提高循证依据的可信度。同时，进一步开展PLGC的中医证候分布规律及其标准化、PLGC证素研究，开发有效制剂，提高PLGC的临床诊治水平和疗效。39 宁夏医科大学硕士学位论文综述参考文献综述参考文献[1]白璐,李青山.晚期胃癌的化学治疗[J].山东医药,2012,52(7):96-98.[2]杜中红,魏晓萍,惠起源.胃癌前病变癌变机制及筛查研究进展[J].现代肿瘤医学,2014,18(4):814-816.[3]何玉善,李娜,刘思德,等.血清胃蛋白酶原、胃泌素-17含量用于筛查慢性萎缩性胃炎的参考值[J].现代消化及介入诊疗,2009,14(1):17-20.[4]张志镒,王贵齐,吴正奇,等.血清胃蛋白酶原检测在胃癌及其癌前病变筛查中的价值[J].世界华人消化杂志,2011,19(14):1511-1514.[5]陈建婷,梁树辉,岳晚霞,等.1A6/DＲIM表达及血清MG7-Ag含量在胃癌早期诊断中的价值[J].现代肿瘤医学,2014,22(8):1888-1890.[6]吴瑾,吴华星,刘丹,等.血清与组织中MG7抗原表达对胃癌前病变风险预测的临床意义[J].中国癌症杂志,2008,18(6):431-435.[7]黄艳春,付文金,戴艳清,等.胃粘膜癌前病变患者胃液中CEA、CA19-9、CA72-4检测的临床意义[J].牡丹江医学院学报,2009,30(3):11-13.[8]贺慧鹏,文海泉.五种肿瘤标记物联合检测对胃癌的诊断价值[J].临床研究,2016,54(1):109-111.[9]夏阳.电子染色内镜对早期胃癌及癌前病变边界的评估价值[J].实用癌症杂志,2014,29(3):290-291.[10]王强,童强,张卫国,等.窄带成像放大内镜联合超声微探头诊断早期食管癌及癌前病变的价值[J].临床消化病杂志,2009,21(4):217-219.[11]周颖,周忠杰,赵佳宏.窄带成像放大内镜在胃黏膜肠上皮化生随访中的应用[J].胃肠病学,2012,17(1):36-38.[12]李庆新,张振坤,李向莉,等.FICE内镜、胃蛋白酶原Ⅰ、胃蛋白酶原Ⅱ水平检测对胃癌及萎缩性胃炎的诊断价值[J].标记免疫分析与临床,2015,22(8):765-768.[13]叶衍铭,戈之铮,萧树东,等.荧光内镜在医疗诊断中的应用观察[J].中国医疗器械杂40 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宁夏医科大学硕士学位论文个人简历个人简历一般情况姓名侯卓成性别男年龄29岁民族汉族籍贯陕西榆林学习与工作经历2008年9月-2013年7月陕西中医学院学士2013年9月-2014年7月定边县中医医院2014年9月-2017年7月宁夏医科大学硕士科研情况参与项目：1.2014年宁夏教育厅项目：基于HIF-α调控的“胃络微型症瘕”理论复方蜥蜴散不同微粒组合剂干预胃癌前病变作用研究（NGY2014096）2.2015年宁夏医科大学资助项目基于SIRT1介导的P53信号通路复方蜥蜴散从毒瘀交阻论治胃癌机制研究（81560769）45