小麦伴生对西瓜枯萎病和根际土壤微生物的影响

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中图分类号学校代码１０２２４密级公开学号１４０４１０３３６表雀人聲硕士学位论文小麦伴生对西瓜枯萎病和根际土壤微生物的影响作者张晓晓导师吴凤芝教授学位类别农学硕士所在学院园艺园林学院一级学科园艺学二级学科蔬菜学二○一七年六月 独创声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究：工作及取得的。，研宄成果据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研宄成果，也不包含未获得（注：如没有其他需要特别声明的，本栏可空）或其他教育机构的学位或证书使用过的材料一。与我同工作的同志对本研宂所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名承ｎ眺別年如２曰］学位论文版权使用授权书、本学位论文作者完全了解学校有关保留使用学位论文的规定，学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借。阅本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后适＿本授权书）学位论文作者签名：多也此日期年０牙曰＂导师签名：多期：別年釦ｆ曰Ｉ ClassifiedIndex：Code：10224Confidential(yes/no)：noNo.140410336DissertationfortheMasterDegreeEffectofWatermelonCompanionwithWheatonFusariumWiltandSoilMicroorganismCandidate:ZhangXiaoxiaoSupervisor:Prof.WuFengzhiDegreeCategory:MasterofAgricultureCollege:CollegeofHorticultureandLandscapeFirstleveldiscipline:HorticultureSecondleveldiscipline:OlericultureHarbinChinaJune2017 目录摘要..............................................................................................................................................................I英文摘要...................................................................................................................................................III1引言..........................................................................................................................................................11.1目的意义...............................................................................................................................................11.2国内外研究进展..................................................................................................................................11.2.1间作（伴生）控制作物病害的研究进展...............................................................................11.2.2根系分泌物.....................................................................................................................................21.2.3土壤微生物.....................................................................................................................................41.2.4根系分泌物介导的植物与土壤微生物....................................................................................51.3技术路线...............................................................................................................................................72材料与方法..................................................................................................................................................82.1试验材料...............................................................................................................................................82.2实验仪器与药品..................................................................................................................................82.2.1实验药品........................................................................................................................................82.2.2实验仪器........................................................................................................................................92.3试验设计.............................................................................................................................................102.3.1小麦伴生对西瓜生长、枯萎病病害以及土壤微生物的影响——盆栽土培试验......102.3.2小麦伴生对西瓜根系分泌物的影响——水培试验...........................................................112.3.3小麦伴生西瓜根系分泌物对西瓜枯萎病病原菌的影响..................................................122.4测定项目及方法................................................................................................................................132.4.1土壤基本化学性状的测定.......................................................................................................132.4.2西瓜病害发生情况的测定.......................................................................................................132.4.3西瓜生长指标的测定................................................................................................................142.4.4土壤微生物群落分析................................................................................................................142.5数据分析.............................................................................................................................................163结果与分析...........................................................................................................................................173.1小麦伴生对西瓜生长的影响..........................................................................................................173.1.1水培条件下小麦伴生对西瓜生长的影响............................................................................173.1.2水培接菌条件下小麦伴生对西瓜生长的影响....................................................................173.1.3盆栽条件下小麦伴生及接菌对西瓜生长的影响................................................................183.2小麦伴生对西瓜枯萎病的影响......................................................................................................193.2.1水培条件小麦伴生对西瓜枯萎病的影响............................................................................193.2.2盆栽条件下小麦伴生对西瓜枯萎病的影响........................................................................203.3小麦伴生西瓜根系分泌物对西瓜枯萎病病原菌的影响..........................................................213.3.1水培条件下小麦伴生西瓜根系分泌物对西瓜枯萎病病原菌的影响............................21I 东北农业大学农学硕士学位论文3.3.2水培接菌的条件下小麦伴生西瓜根系分泌物对西瓜枯萎病病原菌的影响...............223.4小麦伴生及其根系分泌物对土壤假单胞菌和西瓜专化型尖孢镰刀菌菌群丰度的影响.233.4.1伴生西瓜根系分泌物对土壤假单胞菌和西瓜专化型尖孢镰刀菌菌群丰度的影响...233.4.2小麦伴生西瓜对土壤假单胞菌和西瓜专化型尖孢镰刀菌菌群丰度的影响................243.5小麦伴生西瓜对细菌和真菌群落结构和多样性的影响...........................................................253.5.1小麦伴生西瓜对土壤细菌和真菌群落结构的影响............................................................253.5.2小麦伴生西瓜对土壤细菌和真菌菌群多样性的影响........................................................384讨论.......................................................................................................................................................404.1小麦伴生对西瓜生长及病害的影响..............................................................................................404.2根系分泌物对西瓜枯萎病病原菌的影响.....................................................................................404.3小麦伴生及根系分泌物对西瓜专化型尖孢镰刀菌和假单胞菌菌群丰度的影响...............414.4小麦伴生西瓜对土壤微生物群落结构和多样性的影响...........................................................415结论.......................................................................................................................................................44致谢............................................................................................................................................................45参考文献...................................................................................................................................................46附录............................................................................................................................................................56攻读硕士学位期间发表的学术论文.....................................................................................................64II CONTENTSCONTENTSAbstractinChinese................................................................................................................................ⅠAbstractinEnglish.................................................................................................................................Ⅲ1Introduction............................................................................................................................................11.1Purposeandsignificantoftheresearch.......................................................................................11.2Researchprogress..........................................................................................................................11.2.1Researchprogressonintercroppingcontrollingdisease...................................................11.2.2Rootexudates.........................................................................................................................21.2.3Soilmicroorganism................................................................................................................41.2.4Plantandsoilmicroorganismmediatedbyrootexudates.................................................51.3Technologyroadmap......................................................................................................................72MaterialsandMethods.........................................................................................................................82.1Experimentalmaterials..................................................................................................................82.2Experimentalapparatusandregents............................................................................................82.2.1Chemicalreagents..................................................................................................................82.2.2Experimentalapparatus.........................................................................................................92.3Experimentaldesign....................................................................................................................102.3.1Effectofwatermelonwithcompanionwheatongrowth,wiltdiseaseandsoilmicroorganism---experimentalofpot...................................................................................102.3.2Effectofwatermelonwithcompanionwheatonrootexudates---experimentalofhydroponics..............................................................................................................................112.3.3Effectofrootexudatesofwatermelonwithcompanionwheatonpathogenofwatermelonwiltdisease.......................................................................................................122.4Experimentalitemsandmethods...............................................................................................132.4.1Determinationofbasicchemicalpropertiesofsoil.........................................................132.4.2Theincidentofwatermelondisease...................................................................................132.4.3Determinationofgrowthindexofwatermelon.................................................................142.4.4Analysisofsoilmicroorganismcommunity.....................................................................142.5Analysisofdate............................................................................................................................163Resultsandanalysis............................................................................................................................173.1Effectofwatermelonwithcompaniononwatermelongrowth...............................................173.1.1Effectofwatermelonwithcompaniononwatermelongrowthunderhydroponicscondition..................................................................................................................................173.1.2Effectofwatermelonwithcompaniononwatermelongrowthunderhydroponicsconditionwithinoculationpathogen.....................................................................................17III 东北农业大学农学硕士学位论文3.1.3Effectofwatermelonwithcompaniononwatermelongrowthunderpotconditionwithinoculationpathogen......................................................................................................183.2Effectofwatermelonwithcompanionwheatonwatermelonwiltdisease............................193.2.1Effectofwatermelonwithcompanionwheatonwatermelonwiltdiseaseunderhydroponicscondition............................................................................................................193.2.2Effectofwatermelonwithcompanionwheatonwatermelonwiltdiseaseunderpotcondition............................................................................................................................203.3Effectofwatermelonrootexudateswithcompanionwheatonthepathogenofwilt........213.3.1Effectofwatermelonrootexudateswithcompanionwheatonthepathogenofwiltunderhydroponicscondition..........................................................................................213.3.2Effectofwatermelonrootexudateswithcompanionwheatonthepathogenofwiltunderhydroponicsconditionwithinoculationpathogen............................................223.4EffectofwatermelonrootexudatesandwatermelonwithcompanionwheatontheabundantofPseudomonasandFusariumpopulation..............................................................233.4.1EffectofwatermelonrootexudatesontheabundantofPseudomonasandFusariumpopulation...............................................................................................................233.4.2EffectofwatermelonwithcompanionwheatontheabundantofPseudomonasandFusariumpopulation........................................................................................................243.5Effectofwatermelonwithcompanionwheatonsoilbacterialandfungalcommunitystructureanddiversity...............................................................................................................253.5.1Effectofwatermelonwithcompanionwheatonsoilbacterialandfungalcommunitystructure...............................................................................................................253.5.2Effectofwatermelonwithcompanionwheatonsoilbacterialandfungalcommunitydiversity...............................................................................................................384Discussion..............................................................................................................................................404.1Effectofwatermelonwithcompaniononthegrowthandincidencediseaseofwatermelon...................................................................................................................................404.2Effectofrootexudatesonthepathogenofwatermelonwilt..................................................404.3EffectofwatermelonrootexudatesandwatermelonwithcompanionwheatontheabundantofPseudomonasandFusariumpopulation..............................................................414.4Effectofwatermelonwithcompanionwheatonsoilmicroorganismcommunitystructureanddiversity.................................................................................................................415Conclusion.............................................................................................................................................44Acknowledgement...................................................................................................................................45References................................................................................................................................................46Appendix..................................................................................................................................................56PaperspublishedintheperiodofPh.M.education.........................................................................64IV 摘要西瓜（Citrulluslanatus(Thunb.)Matsum&Nakai）是设施栽培作物，近年来随着种植面积的逐渐扩大，西瓜的病害也逐渐加重，其中枯萎病是西瓜常见的土传病害。前期的研究发现，小麦伴生可以降低西瓜枯萎病的发病率，提高叶片的光合性能及相关酶的活性，其中小麦的根系分泌物对尖孢镰刀菌的生长具有抑制作用。但是对于伴生后，西瓜根系分泌物对病原菌的作用，以及土壤微生物菌落的变化状况尚不清楚。本实验通过设置分根处理：西瓜单作和小麦伴生西瓜，研究小麦伴生后，西瓜根系分泌物的作用，通过稀释平板法研究西瓜根系分泌物对尖孢镰刀菌孢子萌发和菌落直径的影响；运用荧光定量（q-PCR），高通量测序（Miseq）技术，研究小麦伴生后对西瓜根际微生物群落丰度，结构和组成的影响。旨在揭示小麦伴生后对病原菌和根际土壤微生物的影响，从而为小麦伴生西瓜栽培模式的推广运用给予理论依据和技术支持。所得出的主要结果如下：（1）在水培条件下，小麦伴生西瓜显著降低了西瓜的地上干重（p<0.05），而接种西瓜专化型尖孢镰刀菌（FON）后，伴生显著促进了地下部的生长（p<0.05）。土培接种FON条件下，小麦伴生显著促进了西瓜的生长（p<0.05）。（2）小麦伴生对西瓜枯萎病发病率影响差异不显著（p>0.05），但显著的降低了枯萎病病情指数（p<0.05）。（3）有无接种西瓜专化型尖孢镰刀菌的条件下，小麦伴生处理的西瓜根系分泌物显著抑制了FON的生长及其孢子萌发（p<0.05）。其中接种FON条件下，西瓜根系分泌物对FON菌落抑制率为7.1%，对孢子萌发的抑制率为32.9%。（4）q-PCR结果表明：伴生与单作的西瓜根系分泌物均未对西瓜专化型尖孢镰刀菌和假单胞菌菌群丰度产生显著影响（p>0.05）。伴生、接菌均未显著改变土壤假单胞菌的菌群丰度（p>0.05）；伴生分根体系中，有小麦侧的土壤中西瓜专化型尖孢镰刀菌的菌群丰度在接菌与否的条件下无显著差异（p>0.05）；接菌条件下，与单作相比，伴生显著降低了土壤中FON菌群丰度（p<0.05），与伴生无小麦侧相比，伴生有小麦侧显著降低了土壤中FON菌群丰度（p<0.05）。说明在伴生分根体系中小麦影响了FON菌群丰度。（5）Miseq测序结果表明：在门水平上，各处理中的细菌主要属于变形菌门，拟杆菌门，放线菌门，酸杆菌门，真菌主要属于壶菌门，子囊菌门，接合菌门，担子菌门。单作体系中的细菌和真菌群落结构在属水平上基本相似。细菌属水平上，接菌条件下，与单作、伴生无小麦侧相比，伴生有小麦侧显著提高了Devosia的相对百分丰度（p=0.017），单作和伴生无小麦侧的群落相对百分丰度无显著差异（p>0.05）。未接菌条件下，与单作相比，伴生有小麦侧显著提高了Devosia，Dyadobacter，Luteimonas，Lysobacter的相对百分丰度（p=0.017，p=0.047，p=0.021，p=0.046），同时降低了norank_o_Subgroup_6，Haliangium，Rhodoplanes，norank_f_RB41（p=0.016，p=0.026，p=0.015，p=0.040）的相对百分丰度，单作和伴生无小麦侧的群落相对百分丰度无差异（p>0.05）。单作，伴生在接菌与否的条件下，它们之间的群落相对百分丰度无显著差异（p>0.05）。在真菌属水平上，接菌条件下，I 东北农业大学农学硕士学位论文与单作相比，伴生无小麦侧提高了Olpidium（油壶菌属）的相对百分丰度（p=0.043），伴生分根体系中接菌侧均降低了Fusarium（镰孢菌属），Nectriaceae_unclassified（未分类的丛赤壳科）的相对百分丰度（p=0.036，p=0.012）；而伴生分根系统中不同处理间在群落组成上相似。未接菌条件下，伴生改变了细菌的群落结构、伴生有小麦侧降低了细菌的Shannon指数（p<0.05）；接菌条件下，伴生改变了真菌的群落组成和结构、伴生有小麦侧降低了真菌的sobs指数（p<0.05）、伴生降低了真菌的Shannon指数（p<0.05）。综上所述，伴生促进了西瓜的生长、降低了西瓜枯萎病的病情指数，接菌条件下，小麦影响了土壤中西瓜专化型尖孢镰刀菌菌群的丰度，伴生改变了真菌群落，对细菌的群落影响不大。关键词：小麦伴生；根系分泌物；西瓜枯萎病；西瓜专化型尖孢镰刀菌；微生物II EffectofWatermelonwithCompanionWheatonFusariumWiltofWatermelonandSoilMicroorganismAbstractWatermelon(Citrulluslanatus(Thunb.)Matsum&Nakai)wasdefinedasakindofcommongreenhousecrops,inwhichtheincidencesofwatermelondiseases(especiallyforthewatermelonfusariumwilt)inducedbyexpansionsofthecultivationwereincreasedwiththeareainrecentyears.Previously,theresearcherspointedthattheincidencesofwatermelonfusariumwiltwerereducedbycompanionwiththewheat,indicatingthatthephotosyntheticperformanceandrelatedenzymeactivitywereelevatedandsimultaneouslythegrowthofFusariumoxyxporumf.spniveum(FON)wassuppressedbythewheatrootexudates.However,literaturesaboutefficacyofwatermelonrootexudatesontheFONandchangesofthesoilmicroorganismcommunitywerenotillustratedbyplantingwatermeloncompanionwithwheat.Inthisresearch,theeffectsofwatermelonrootexudatesonsporegerminationandmyceliumgrowthofFONinvitrowereinvestigated;Furthermore,theabundance,structureandcompositionofrhizospheresoilmicrobialcommunitiesweremeasuredbyq-PCRandMiseq,respectively.WeaimedtounraveltheeffectsofwatermelonrootexudatesonFONandthesoilmicroorganism,thusprovidingthetheoreticalbasisandtechnicalsupport.Themainresultswereasfollows:(1)Underhydroponicconditionsthedryweightofshootinwatermeloncompanionwithwheatwassignificantlydecreased(p<0.05).However,inoculatingFONsignificantlypromotedthegrowthofroots(p<0.05).Plus,underpotculturethegrowthofwatermelonwithinoculationFONwassignificantlyenhancedbycompanionwithwheat(p<0.05).(2)Therewerenosignificantdifferencesinincidencesofthewatermelonfusariumwiltbetweenthemonocultureandcompanion(p>0.05),whiletheindexofdiseasewassignificantlyattenuated(p<0.05).(3)TherootexudatesofwatermeloncompanionwithwheatnotablysuppressedcolonygrowthandsporegerminationofFONbyinoculationofFONornot(p<0.05).TheinhibitionratesofFONcolonygrowthandsporebyinoculatingFONwere7.1%and32.9%,respectively.(4)Byq-PCRanalysistheresultsdemonstratedthatthereexistednodifferencesinrelativeabundanceofPseudomonasandFONinthemonocultureandcompanionofwatermelonrootexudates(p>0.05).TherelativeabundanceofPseudomonaswerenotchangedundertheconditionofcompanionandinoculationFON(p>0.05).UnderinoculationFON,comparedwithmonoculture,thecompanionsignificantlydecreasedtherelativeabundanceofFusarium(p<0.05);therelativeabundanceofFusariumwaslowerinthecompanionwithwheatsidethanIII 东北农业大学农学硕士学位论文withoutwheatside(p<0.05),whiletherewerenodifferencesinoculationFONornotinthecompanionwithwheatside(p>0.05),indicatingthatthewheatplayedtheimportantroleincompanionsystemforpathogens.(5)Miseqsequencingresultsshowedthatatthephylumlevel,themaincommunitieswereProteobacteria,Bacteroidetes,Actinobacteria,AcidobacteriainthebacterialandAscomycota,Zygomycota,Basidiomycotainthefungal.Thebacterialandfungalstructuresamongthemonocultureweresimilarinthecompanionsystematthegenuslevel.Asforbacterial,withcomparedofthemonoculturewithinoculationandthecompanionwithinoculationFON(withoutwheatside),therelativeabundantofDevosiawerehigherinthecompanionwithinoculationFON(wheatside)(p=0.017).However,therewerenodifferencesbetweenthemonoculturewithinoculationFONandthecompanionwithinoculationFON(withoutwheatside)(p>0.05).Thecompanionwithnon-inoculationFON(withwheatside)increasedtheabundantofDevosia,Dyadobacter,Luteimonas,Lysobacte(p=0.017,p=0.047,p=0.021,p=0.046)anddecreasedtheabundantofnorank_o_Subgroup_6,Haliangium,Rhodoplanes，norank_f_RB41withcomparedthemonoculturewithoutinoculationFON(p=0.016,p=0.026,p=0.015,p=0.040).TheabundantofcommunitiesbetweenthemonoculturewithoutinoculationFONandthecompanionwithnon-inoculationFON(withoutwheatside)werenodifferent(p>0.05).Thereweresimilarabundantofcommunitiesbetweenthemonocultureandthecompanionweatherinoculationornot(p>0.05).Atthegenusleveloffungal,therelativeabundantofOlpidiumwashigherinthecompanionwithinoculationFON(withoutwheatside)thanthemonoculturewithinoculationFON(p=0.043).ThecompanionwithinoculationFONhadlowerrelativeabundantofFusariumandNectriaceae-unclassified(p=0.036,p=0.012)whileitwerenodifferencesamongthetreatmentinthecompanionsystem(p>0.05).Undernon-inoculationFONcondition,thecompanionchangedthestructureofbacterialcommunityandthecompanion(withwheatside)decreasedtheShannonofbacteria(p<0.05).UnderinoculationFONcondition,thecompanionchangedthestructureandconstituteoffungalcommunityanddecreasedtheShannonoffungal(p<0.05).Insummary,companionwithwheatpromotedthegrowthofwatermelonandattenuatedthediseaseindexesofwatermelonfusariumwilt.ThecompanionwithwheatsidedecreasedtheabundancesofFusarium,andthecompanionchangedthefungalcommunityunderinoculationFONcondition,however,itwasnoteffectonthebacterialcommunity.Keywords:watermelonwithcompanionwheat;rootexudates;watermelonfusariumwilt;FON;microorganismCandidate:ZhangXiaoxiaoSpeciality:OlericultureSupervisor:Prof.WuFengzhiIV 引言1引言1.1目的意义西瓜（Citrulluslanatus(Thunb.)Matsum&Nakai）是人们夏天清热消暑的常备水果，也是设施栽培作物。近年来随着种植面积的逐渐扩大，西瓜的病害也逐渐的加重，其中枯萎病是其常见的土传病害。西瓜枯萎病的病原菌为西瓜专化型尖孢镰刀菌（Fusariumoxyxporumf.spniveum（E.F.Smith）Snyder&Hansen，FON），由它侵染植株破坏维管束而产生枯萎病害，它的侵染可发生在西瓜生长的各个时期。防治西瓜枯萎病已经是一个世界性的课题，深入研究解决这个问题具有重要的意义。根系分泌物是连接植物与土壤进行物质互换和信息传递的重要载体，它的组分和含量的变化是植物应对外界胁迫和调控根际微生物形态的关键成分。目前，对于根系分泌物的研究多集中在营养胁迫，重金属胁迫，外接菌，嫁接下根系分泌物的变化以及不同抗性品种之间根系分泌物的差异等[1-5]，而对于在不同的栽培制度下，作物分泌物的变化的研究较少，它们发挥的作用也尚不清楚。本课题组前期的研究发现[6-7]，小麦伴生可以降低西瓜枯萎病的发病率，提高叶片的光合性能及相关酶的活性，其中小麦的根系分泌物对尖孢镰刀菌的生长具有抑制作用，但是其机理尚不清楚，而且对于伴生后，西瓜根系分泌物对根际微生物的影响是否有差异？伴生控制病害中，小麦的作用如何？因此，本研究以西瓜和小麦为试验材料，研究小麦伴生后，西瓜根系分泌物的作用，利用连续收集系统收集了西瓜的根系分泌物，通过平板实验测定西瓜根系分泌物对尖孢镰刀菌孢子萌发和菌丝生长的影响；运用qPCR，高通量测序技术，研究小麦伴生后对西瓜根际微生物群落丰度，结构和组成的影响。旨在揭示小麦伴生后对病原菌和根际土壤微生物的影响，从而为小麦伴生西瓜栽培模式的推广运用提供理论依据和技术支持。1.2国内外研究进展1.2.1间作（伴生）控制作物病害的研究进展伴生是一种特殊的间作形式，它是利用植物间的相生相克作用，在主栽作物的旁边种植伴生作物，伴生作物不以收获为目的的栽培模式[8]。目前对于伴生的研究热点主要集中在伴生作物对植物的生长和病虫害防治上。伴生的方式很多，国内的伴生作物主要是化感作用较强的作物如分蘖洋葱伴生番茄[9]、菜豆[10]，大葱伴生黄瓜[11]、番茄[12]，还有小麦伴生西瓜、黄瓜[13]，茼蒿伴生西瓜[14]等；国外在生产实际中发挥作用的主要有：芥菜伴生羽衣甘蓝[15]，绛车轴草伴生茄子[16]，矢车菊伴生甘蓝[17]，番茄伴生甜玉米[18]，三叶草伴生卷心菜[19]，万寿菊伴生番茄[20]等。近些年来，伴随着农业的可持续发展，间套作作为一种有效的生物防治病虫害的方式1 东北农业大学农学硕士学位论文也得到了广泛应用。大量的研究表明，间作可以有效地控制植物的病害。草坪草与番茄间作，增加了番茄根部的菌根数量，降低了番茄叶枯病的发病状况[21]。韭菜跟香蕉间作种植时，能够显著降低香蕉萎蔫病的发病率[22]。玉米与番茄间作能够缓解番茄白粉病的发病情况[23]，而且分蘖洋葱伴生番茄能够显著的降低番茄灰霉病的病情指数[9]。某些小麦品种与蚕豆间作，可以有效地控制蚕豆枯萎病的发生[24]。玉米与辣椒间作时，玉米能够在辣椒的周围产生“根墙”，并且会释放一些物质，这些物质会吸引辣椒疫霉的游动孢子，并限制它的生长，从而降低了辣椒疫病的发生[25]。Ivanka[20]利用万寿菊，罗勒，莴苣和白芥菜作为番茄的伴生作物，研究发现这些伴生作物在一定程度上均能抑制根结线虫的生长，其中白芥菜和万寿菊的效果最为显著。1.2.2根系分泌物1.2.2.1根系分泌物的分类根系分泌物[26]是指植物在生长过程中，由根部向根际环境中释放的各种有机物质的总称。根系通过分泌各种物质，可以改善根际的微生物群落结构，促进有益微生物共生，改变土壤的理化性质，从而可以妨碍一些不利于植物的微生物的生长。根系分泌物的分类方法很多，但大多数人认同将根系分泌物划分为2大类[27]，1）低分子量的分泌物，如氨基酸，糖类，有机酸，酚酸以及其他的次级代谢物；2）高分子量的分泌物，如粘液（多糖），蛋白质等。根系分泌物的种类繁多，目前研究较多的是低分子量物质。表1-1在前人[28-29]的基础上，总结概括了已发现的一些根系分泌物的具体组分。表1-1根系分泌物中发现的化合物Fig.1-1Foundofchemicalcompoundintheexudates种类根系分泌物中鉴定的化合物谷氨酸，丙氨酸，色氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，半胱氨酸，胱氨酸，γ-氨基丁酸，天冬氨酸，氨基酸类天冬酰胺，丝氨酸，脯氨酸，精氨酸，甲硫氨酸，甘氨酸，苏氨酸，缬氨酸，苯丙氨酸，谷氨酰胺，赖氨酸脂肪酸亚油酸，亚麻酸，十八烯酸，软脂酸，硬脂酸阿拉伯糖，果糖，岩藻糖，半乳糖，葡萄糖，麦芽糖，低聚糖，棉子糖，鼠李糖，核糖，木糖，糖类寡糖，聚多糖，蔗糖阿魏酸，原儿茶酸，水杨酸，丁香酸，香草酸，咖啡酸，肉桂酸，香豆酸，邻羟基香豆酸，杏酚酸类仁酸，对羟基苯甲酸，3,4-二羟基苯甲酸，4-羟基-3-甲氧基苯甲酸，3,4-二甲氧基苯甲酸，4-羟基苯乙酸醋酸，己二酸，丁酸，柠檬酸，富马酸，戊二酸，羟基乙酸，羟基戊二酸，乳酸，顺丁烯二酸，有机酸苹果酸，丙二酸，草酸，丙酸，丙酮酸，戊酸，酒石酸，琥珀酸淀粉酶，转化酶，磷酸酯酶，多聚半乳糖醛酸酶，硝基还原酶，硫酸酶，木聚糖酶，吲哚乙酸酶类氧化酶，蛋白酶，脲酶，接触酶（转下页）2 引言（接上页）种类根系分泌物中鉴定的化合物甾醇类油菜甾醇，胆甾醇，谷甾醇，豆甾醇核苷酸和腺嘌呤，胞二磷胆碱，黄酮，鸟嘌呤，尿核苷黄酮类对氨基苯甲酸，植物生长激素，胆碱，肌醇，烟酸，泛酸，硫胺素，尼克酸，维生素H，生长因子维生素B1，维生素B5，维生素B6其它成分CO2，乙烯，植物抗毒素，荧光物质，糖苷，氢氰酸，有机磷化合物，多肽，皂苷，麦根酸类植物铁载体，独脚金内酯等注：根据文献[28-29]总结。1.2.2.2根系分泌物的收集在研究根系分泌物时，必须依据不同的研究目的对根系分泌物进行不同的定量/定性分析。其中根系分泌物的收集是研究根系分泌物的第一步，也是关键的一步。目前关于根系分泌物的收集方法很多，但是没有明确的分类，常用的主要有溶液收集法，土培法和基质栽培法，连续收集法。溶液收集法。将生长良好的植物取出，并保、持其根系的完整性，将植物放入盛有蒸馏水的装置中通气培养一段时间后，收集此溶液，此溶液即为该植物的根系分泌物。此方法简单易行，但是在取根时易造成根系损伤，从而使得根系分泌物发生变化。这种收集法的要求不是很严格，而且在实际收集过程中，对于培养时间及根系分泌物浓度的计算方式没有规定。常用的培养时间有2h，4h，6h，24h等[30]，主要的定量方式有每株植株中含有多少根系分泌物或每克根重中含有多少分泌物[30-31]。土培法和基质栽培法。将植物收集后，取土壤或基质，并加入一定比例的蒸馏水浸泡，收集浸泡液，经过滤浓缩后即为根系分泌物的母液。目前，人们经常使用的基质有珍珠岩，蛭石，人造营养土，石英砂和琼脂等。甄文超[32]收集了培养草莓的蛭石，将其与等量的蒸馏水混合，经震荡，离心，旋转蒸发等处理后获得了草莓的根系分泌物；周艳丽[33]通过将含有分泌物的琼脂经高温熔化后获得了大蒜的根系分泌物；董哲[34]将植物的根际土与无菌水混合后经震荡，离心，过滤后得到了沙棘的根系分泌物；张宁通过使用无菌水冲洗水稻的根际土的方法，获得了水稻的根系分泌物[35]。连续收集法。此方法是利用连续收集装置在根系原位收集，避免了对根造成伤害，实现了持续，富集，实时，高效的收集根系分泌物。它的一般工作原理是营养液在循环流动的过程中可以使得根系分泌物在收集器里不断地富集，再通过洗脱的方式得到根系分泌物[36]。收集装置的种类很多，但主要包括培养室，收集柱以及循环装置。利用该类装置收集根系分泌物时应注意对树脂柱和洗脱剂的选择。人们利用收集装置实现了对牛鞭草，黄瓜，3 东北农业大学农学硕士学位论文大豆，西瓜等根系分泌物的收集[37-40]。1.2.2.3根系分泌物与病原菌在农生产中，植物的土传病害是影响经济产量的重要限制因素。土传病原菌可以在土壤中存在很多年，能够持续的影响植物的生长，而且与其它病害相比，它们的症状不易识别，因而与侵染植物的地上病菌相比，土传病害在管理和防治上更为困难。植物的根系分泌物具有某些化感作用，它们可以直接作用于病原菌。徐宁等[41]的研究表明大葱的根系分泌物可以直接的抑制黄瓜枯萎病病原菌的菌丝生长和孢子萌发；董艳等[5]发现不同抗性品种的蚕豆的根系分泌物对尖孢镰刀菌的作用不同，在抗病品种的根系分泌物中FON的孢子萌发和菌丝生长受到抑制，而中抗品种则能够促进它的孢子萌发但对它的菌丝生长没有影响，感病品种的根系分泌物能够促进孢子的萌发和菌丝生长；Ning[42]实验证实了嫁接西瓜的根系分泌物能够抑制枯萎病病原菌的生长，而自根西瓜的根系分泌物则对其生长有促进作用。植物在受到病原菌胁迫时，通过调整根系分泌物的种类和含量来抵制侵染，维持正常的生长。研究植物在不同状况下对于胁迫的反应，可以使我们通过外源添加成分或是采用合理的作物栽培方式来减轻植物的病害。韩雪[43]的研究表明黄瓜根系分泌物中葡萄糖，蔗糖，可溶性糖的含量随着黄瓜抗性的增加而降低，而且根系分泌物中总氨基酸的含量随着抗性的增加而降低；郝文雅[44]通过收集西瓜和水稻的根系分泌物，研究其组分中的糖和氨基酸对西瓜专化型尖孢镰刀菌生长的影响时得出了相似的结论。嫁接茄和自根茄受到黄萎病病原菌的胁迫后，从根系分泌物中检测出较多含量的丁二酸二甲酯，它在田间能够显著降低黄萎病的发病率和病情指数[45]。有机酸分泌总量随蚕豆品种对枯萎病的抗性增加而升高，其中苹果酸含量越高，抗病性越强，而酒石酸和延胡索酸对枯萎病的发生具有重要影响[5]。Lanoue[46]的研究证明，大麦在受到土传病原菌镰刀菌的侵染后，会从头合成和分泌些抗菌的物质来介导它的抗性，如酚酸类物质。Ning[42]证明了西瓜根系接种尖孢镰孢菌或多粘类芽孢杆菌SQR-21后根系分泌物中肉桂酸的含量发生了明显的变化，说明西瓜对尖孢镰刀菌的抗性与根系分泌物中肉桂酸的含量有关。水稻与西瓜间作模式中，西瓜根系分泌物中的组分：阿魏酸，水杨酸，苯甲酸，肉桂酸含量下降，而香豆酸的分泌量与之相反，并且香豆酸的含量与西瓜根系尖孢镰刀菌数量存在正相关关系，从而找到了水稻和西瓜间作能够有效地降低西瓜连作土传病害的主要原因[47]。此外，一些研究表明，某些双萜物质，独脚金内酯在抵抗病原菌的攻击上也发挥着作用[48-49]。前期的研究表明小麦伴生西瓜能够降低枯萎病的发病率，在此过程中西瓜的根系分泌物是否发生变化呢？这些变化与病害是否有关呢？这些问题亟待解决。1.2.3土壤微生物土壤微生物是指生活在土壤中的细菌、真菌、放线菌及藻类的总称，它们是土壤的重要组成部分，也是决定植物健康和产量的重要因素。不同的土壤基质，植物类型，营养条4 引言件都会使得微生物的群落结构发生改变[50]，变形菌纲包括α-，β-，γ-变形菌，他们在自然界中无处不在；鞘脂单胞菌属和鞘脂菌属能够产生生长素，尤其是在番茄的根际[51]；放线菌在土壤微生物中占了很大的比例，约占30%，能够促进营养循环，增加磷的吸收，是植物生长促生根际菌[52]，而且放线菌中的某些类群还会用来作生防剂，如地嗜皮菌属[53]；拟杆菌门的Adhaeribacter和Flaibacterium能够降低高度复杂的多聚化合物，他们大多数来自细菌，线虫，植物在根际的组分以及肥料的组分[54]。随着马铃薯连作年限的增加，真菌群落的变化不大，细菌群落的多样性降低，使得尖孢镰刀菌的数量增多，而且尖孢镰刀菌与酸杆菌纲和变形菌纲呈负相关[55]。在根际环境中，植物根系与土壤微生物相互作用显著的改变了土壤物理化学性质，同时也会使根际的微生物群落发生变化。微生物群落组成的变化均表明了寄主植物对于微生物具有识别作用，能够选择性的使其在根际定殖，从而更加有利于植物的生长[56]。微生物不仅可以作为信号分子来提高植物的抗性，也可以促进植物的营养吸收和作用于病原微生物。假单胞菌，杆菌，木霉菌，菌根真菌可以作为信号分子增强植物对病原菌的防御作用，提高植物的系统抗性[57]。荧光假单胞菌能够促进禾本科植物和双子叶植物对铁营养的吸收，根霉产生的rhizoferrin是铁的有效运载者，从而有效的提高了植物对铁的吸收；土壤杆菌可以产生土壤杆素84从而对病原菌具有抗菌活性；微生物产生的易挥发成分在抑制病原菌上也发挥着重要的作用，如嗜麦芽窄食单胞菌、沙雷氏菌、铜绿假单胞菌，枯草芽孢杆菌，洋葱伯克霍尔德菌能够抑制植物病原真菌菌丝体的生长[58]。有些研究表明[59]，在抑制植物病害上是各种微生物共同作用的结果，而不是某些类群的单独作用。1.2.4根系分泌物介导的植物与土壤微生物根系分泌物是植物与土壤微生物进行信息交流和物质交换的的重要载体，是构成土壤微生物群落的关键因素[60]，根系分泌物影响下的植物-微生物互相作用关系变化能够改变土壤肥力、健康状况，以及植物生长发育的状态。Badri[61]发现根际土壤微生物的多样性能够调节植物的生长及叶片的代谢活动，叶片氨基酸的含量与土壤微生物的组成呈正相关。并且根系分泌物随着不同发育阶段而变化，其中拟南芥的根系分泌物中糖和糖醇的含量随着它的生长发育而降低，而氨基酸和酚酸的变化则相反，通过对根际mRNA焦磷酸测序得出微生物功能基因的表达与植物不同生长阶段的根系分泌模式高度相关[62]。植物依据根系分泌物的分泌形成土壤微生物群落。根系分泌物既是微生物的生长基质又能充当抗菌物质进而影响微生物的生长，它的浓度和组分的变化都会对微生物产生不同的作用，使得微生物群落发生改变。在苜蓿和拟南芥系统中添加外来植物的根系分泌物会使得土壤中的真菌群落结构和生物量降低[63]。而且不同生长阶段的植物具有不同的根际微生物群落，拟南芥在幼苗期，营养生长期和抽蔓期的微生物群落组成显著不同，其中变化最为明显的是变形菌门和厚壁菌门的微生物群落[64]。植物可以选择和吸引特定的微生物群落，因而能够改变根际微生物群落的组分和多样性。与野生型相比拟南芥ABC运载突变体分泌的酚酸类比糖类多，使得它的天然微生物群落发生显著的变化。有机酸有益于微生物的繁殖提高其活性，包括病原菌和有益菌。Scoohbeek[65]发现草酸是灰霉孢菌侵染过程5 东北农业大学农学硕士学位论文中的致病因素。Wu[66]的研究表明，草酸既可以诱导青枯病的趋化作用，也能够增加它的生物膜数量。根系分泌物中的苹果酸能够招募B.subilis在根际的定殖，而B.subilis可以诱导植物体内的脱落酸和水杨酸信号通道，导致了气口的关闭从而限制了病原菌的入侵[67]。Rudrappa[68]利用DC3000侵染叶片时，发现根系分泌物中的苹果酸含量显著增加，并且能够招募根际中的枯草芽孢杆菌FB17在根系繁殖，从而降低了病原菌对拟南芥的危害。Yuan[69]在香蕉根系分泌物中发现，延胡索酸能够显著的促进解淀粉芽孢杆菌NJN6生物膜的形成。土壤微生态环境的改变影响了土壤微生物多样性的变化。土壤微生物是土壤中活的有机体，同时也是土壤肥力的活跃因子，它们的区系组成和变化往往能够显示出土壤生物活性水平。因此对于土壤微生物多样性状况一般使用微生物丰度和均度等指标来描述，丰度一般指微生物的数量，均度为相对丰富程度，它们的定量反映了土壤微生物区系的变化程度。植物的根系可以分泌对微生物生长有益的糖类，氨基酸，生长素等物质，促进有益菌在根部的繁殖，还可以分泌一些化感物质如酚酸可以抑制病原菌的繁殖，从而改变了根际微生物的种类、数量和分布，对微生物的群落结构具有选择塑造的作用。内生真菌侵染高羊茅后，可以影响高羊茅的根系分泌物，使其种类增多，进而影响了土壤微生物结构[70]；小麦伴生后，黄瓜根际土壤中真菌群落香农指数和均匀度指数显著下降，改变了土壤真菌结构[71]。土壤中真菌，细菌及放线菌比例不同，对植物生长的影响不同。棉花与不同作物同穴育苗，小麦伴生西瓜，西瓜套作均会改变区系的微生物结构，减少了真菌数量，增加了细菌放线菌的数量[72-74]，从而增加了有益菌的比例，为植物的生长塑造了良好的生长环境，进而降低了发病率。向土壤中添加香豆酸也能改变土壤微生物的结构，同时有利于尖孢镰刀菌在根部的繁殖[75]。小麦伴生后，能否引起土壤微生物群落的变化？是怎么变得呢？这些变化主要是由什么引起的？这些问题亟待解决。6 引言1.3技术路线西瓜分根处理水培实验土培实验根系分隔/不分隔不接菌/接菌接菌根系分泌物的收集发生病长根对指际率尖标土，孢的收病镰测集情刀指定菌数的影响菌孢R高R丝子Cq干通Cq生萌-P鲜量-P长发重测序揭示小麦伴生对西瓜枯萎病害及其土壤微生物的影响7 东北农业大学农学硕士学位论文2材料与方法2.1试验材料供试土壤：大田土，其基本化学性状为铵态氮31.6mg·kg-1，硝态氮22.46mg·kg-1，速效钾207mg·kg-1，速效磷74.31mg·kg-1，全磷1.6g·kg-1，全氮1.13g·kg-1，有机质57.17g·kg-1，pH7.01，EC值5.98ms·cm-1。主栽作物：西瓜（Citrulluslanatus(Thunb.)Matsum&Nakai），品种为黑美人（感病品种），购于农友种苗股份有限公司。伴生作物：小麦（TriticumaestivumLinn.），品种为D123，由东北农业大学园艺学院蔬菜生理生态研究室提供；菌种：西瓜专化型尖孢镰刀菌（Fusariumoxyporumf.sp．niveum（E.F.Smith）Snyder&Hansen,FON），分离于向阳农场塑料大棚内的西瓜枯萎病的病株，保存在生理生态实验室。试验地点：本实验于2015年4月-2017年2月，在东北农业大学园艺站温室及设施生理生态实验室完成。2.2实验仪器与药品2.2.1实验药品表2-1化学试剂Tab.2-1ChemicalReagents实验药品实验药品实验药品实验药品氯化钾硝酸钾草酸氯化钠碳酸氢钠硝酸铵柠檬酸EB磷酸二氢钾磷酸二氢钾苹果酸琼脂糖氨水硫酸镁酒石酸丙烯酰胺次氯酸钠硝酸钙丙二酸尿素酒石酸钾氯化钴富马酸感受态细胞水杨酸钠硫酸亚铁琥珀酸胰蛋白胨醋酸EDTA二钠盐乙腈酵母粉醋酸铵碘化钾磷酸酵母提取物碳酸钠硼酸琼脂TIANGEN,IPTG（转下页）8 材料与方法（接上页）实验药品实验药品实验药品实验药品氯化铵硫酸锌甲醇DL2000marker二氯异氰尿酸钠硫酸铜葡萄糖X-Gal磺胺硫酸锰硫酸链霉素AMP柠檬酸三钠氢氧化钠PCRMasterMix硝酸钠钼酸钠RealSYBRMixture2.2.2实验仪器表2-2实验仪器Tab.2-2ExperimentApparatus仪器名称型号产地电子天平ALC-210.4哈尔滨市东明医疗仪器厂恒温培养箱DHSOOOA天津市泰斯特仪器有限公司恒温摇床HWY111上海智诚分析仪器制造有限公司电热恒温水浴锅DK-98-I天津市泰斯特仪器有限公司立式压力蒸汽灭菌锅LDZM-60KCS上海申安医疗器械厂超净工作台BCN-I360B哈尔滨市东联电子技术有限公司pH计FE20上海电导仪FE30上海超声波清洗器KQ-500E昆山市超声仪器有限公司高速离心机BeckmanJ2-MC美国紫外成像仪UVPLabwork4.6美国流动分析仪SAN++荷兰SKALAR酶标仪Epoch美国Bio-TekPCR仪PTC-20美国荧光定量PCR仪Bio-RadiQ5美国电泳仪Mupid-21日本制冰机FM-500E北京长流科学仪器公司漩涡混合器G560E美国紫外成像仪UVPLabwork4.6美国电泳槽DYY-8C北京六一9 东北农业大学农学硕士学位论文2.3试验设计为消除伴生的小麦对西瓜根系分泌物的直接的影响，将西瓜根系分为2部分，一侧伴生小麦，另一侧不伴生小麦，其不伴生小麦侧的西瓜的根系分泌物的变化即为不受小麦直接影响的。选取籽粒饱满，大小一致的西瓜种子，在55℃恒温水浴锅中温烫浸种0.5h，边浸泡边用玻璃棒搅拌；在常温水中浸泡10-12h（此时种子多数沉在杯底），最终放在28℃的恒温箱中催芽。大约2天种子露白后，选取发芽程度整齐一致的种子并将其胚根去除[76-78]（为了促进侧根的生长，利于将根均匀地分成两部分），播种在育苗盘中。2.3.1小麦伴生对西瓜生长、枯萎病病害以及土壤微生物的影响——盆栽土培试验注：左边为伴生小麦有小麦侧；右边为伴生小麦无小麦侧图2-1分根单作图2-2分根伴生Fig.2-1Split-rootmonocultureFig.2-2Split-rootcompanion将供试土壤混合均匀后装入塑料盆（240×180mm）中，每盆2.5kg。实验共有3个处理，每个处理10株西瓜，重复3次。西瓜分根间隔体系由两个分隔室组成，两个分隔室中的根系及微生物互不干扰。将二叶一心的西瓜苗根系分成均等的两份分别种植于两个分隔室中（图2-1），当西瓜四叶一心时，在西瓜的一侧种植伴生小麦（图2-2）。在生长过程中及时修剪小麦，使其不影响西瓜的生长。伴生10天后，采用灌根的方法进行接菌处理，10 材料与方法如图2-3所示。接菌20天后，取样，测定植物的生长指标及发病率，收集西瓜两侧根际土（方法：先将根表面的土抖落掉，再用毛刷刷取根表面的土，刷落的土即为根际土），将获取的根际土过2mm的筛，-80℃保存备用，用于微生物群落分析。A+FA1+FA1+Fw图2-3试验处理及编号Fig.2-3Numberoftreatment2.3.2小麦伴生对西瓜根系分泌物的影响——水培试验将育苗盘中两叶一心的西瓜幼苗移栽到含有1/2Hoagland营养液的分隔水培箱中，自制水培箱的规格为：长70cm，宽20cm，外高18cm，内高15cm，每箱种植5株西瓜，使得水培箱的两侧各含有西瓜的一半根系（图2-4）。通气培养，待其长至3-4片真叶时换成全营养液培养。当西瓜四叶一心时，在实验组的一侧种植伴生小麦（图2-5）。实验共2个处理，①西瓜单作，作为对照；②小麦伴生西瓜，在西瓜的一侧伴生小麦123，另一侧不伴生。每处理有5株西瓜，重复三次。当小麦长到30cm时，留5cm茬口割掉，使其不影响西瓜正常的生长。实验1：收集西瓜根系分泌物伴生10天后，利用连续收集装置收集实验组无小麦侧的根系分泌物和对照组一侧的根系分泌物。5天后取下树脂柱。实验2：接菌后，收集西瓜根系分泌物伴生10天后，在伴生的无小麦侧和单作的一侧接种西瓜专化型尖孢镰刀菌。接菌15天后，利用连续收集装置收集接菌侧的根系分泌物。5天后取下树脂柱。用200mL甲醇洗脱，过0.45µm的膜，用旋转蒸发仪在35℃旋转蒸发，最终将根系分泌物的浓度定量为1g干重·10mL-1，储存在-20℃中，用于根系分泌物对尖刀镰孢菌影11 东北农业大学农学硕士学位论文响的稀释平板实验。图2-4水培条件下分根单作Fig.2-4Spilt-rootmonocultureunderhydroponiccondition注：左边为伴生小麦无小麦侧；右边为伴生小麦有小麦侧图2-5水培条件下分根伴生Fig.2-5Split-rootcompanionunderhydroponiccondition2.3.3小麦伴生西瓜根系分泌物对西瓜枯萎病病原菌的影响2.3.3.1对西瓜专化型尖孢镰刀菌孢子萌发的影响配置PDA液体培养基（200g土豆，20g葡萄糖配置成1L溶液），接入6mm的尖孢镰刀菌的菌饼，在28℃，130r/min的摇床上培养3天，形成浓度约为1×103cfu·mL-1的孢子悬浮液。取制备好的各处理的根系分泌物2mL，过0.22µm滤膜，分别加入到100mL冷却至40℃的灭菌固体PDA培养基（200g土豆，20g葡萄糖，20g琼脂配置成1L溶液）12 材料与方法中，并加入100µL的抗生素，混合均匀后平均地倒入5个平板中。每个平板涂布0.2mL孢子悬浮液，恒温28℃下暗培养2天。2天后记录平板菌落个数，每处理重复5次。2.3.3.2对西瓜专化型尖孢镰刀菌菌丝生长的影响取制备好的各处理的根系分泌物2mL，过0.22µm滤膜，分别加入到100mL冷却至40℃的灭菌固体PDA培养基（200g土豆，20g葡萄糖，20g琼脂配置成1L溶液）中，并加入100µL的抗生素，混合均匀后平均地倒入5个平板中。每平板接入直径为6mm的菌饼，每个重复5次，然后在恒温28℃下暗培养6天。6天后用十字交叉法测定菌落直径。2.3.3.3对西瓜专化型尖孢镰刀菌和假单胞菌菌群丰度的影响50g干土放入培养皿（d=10cm）中，在20℃下暗培养14天，期间使用用无菌水保持70%的含水量。第15天时，每克土接种尖孢镰刀菌4×105个，并且每天喷施C浓度维持在0.3mgC·g-1土干重的根系分泌物，混合均匀，然后20℃下再连续暗培养15天[79]。实验分为三个处理：1对照（无菌水）；2单作西瓜根系分泌物；3伴生西瓜根系分泌物。30天时收获土壤，并于-80℃保存，后期用于测定西瓜专化型尖孢镰刀菌和假单胞菌的菌群丰度。2.4测定项目及方法2.4.1土壤基本化学性状的测定测定方法参照鲍士旦的方法[80]。土壤养分测定：硝态氮，铵态氮，速效钾，速效磷，全氮，全磷的含量采用荷兰SKALAR的连续流动分析仪SAN++测定；有机质采用重铬酸钾容量法；土壤pH的测定：按土水比1:5用pH计测定；土壤EC值的测定：按土水比1:5用DDS-11A型电导率仪测定。2.4.2西瓜病害发生情况的测定西瓜枯萎病病害发生情况调查西瓜枯萎病发病程度分为0-4共5个级别[81]：0级为：植株正常生长；1级为：叶片或茎部萎蔫面积占全株的1/4或不到1/4；2级为：叶片或茎部萎蔫面积占全株的1/2；3级为：叶片或茎部萎蔫面积占全株的3/4；4级为：全株萎蔫死亡。病情指数＝∑（病情级别×该级病株数）/最高级数×调查总株数×100。13 东北农业大学农学硕士学位论文发病率＝发病株数/调查总株数×100%2.4.3西瓜生长指标的测定采用电子天平称量植株干鲜重（地上干重和地下干重是将植株鲜样置于烘箱65℃条件下，烘干直至植株恒重后称量）。2.4.4土壤微生物群落分析2.4.4.1土壤DNA的提取西瓜根际土壤微生物的DNA采用PowerSoilDNAIsolationKit（MOBIOLaboratories，CA，USA）试剂盒提取。①称取0.28g土壤加入PowerBeadTube，颠倒震荡混匀；②检查C1是否有沉淀，如果有沉淀，60℃水浴加热溶解；③加入60µLC1，涡旋10min，然后在4℃，10000g下离心1min；④转移600µL的上清液于一个新的2mL管中，加入250µL的C2，涡旋5s，4℃保持5min，然后在4℃，10000g下离心1min；⑤转移上清液于一个新的2mL管中，加入200µL的C3，涡旋5s，4℃保持5min，4℃，10000g下离心1min；⑥转移750µL上清液于一个新的2mL管中，加入1.2mL的C4，涡旋5s，混合均匀；⑦吸取675µL溶液加入SpinFilter中，4℃，10000g下离心1min，倒掉管中的液体；重复三次，直到把溶液转移完；⑧在SpinFilter中加入500µLC5，4℃，10000g下离心1min，倒掉管中的液体；⑨将SpinFilter空离一次，10000g下离心1min，倒掉管中的液体，并吸取管壁上的酒精；⑩加入100µLC6，4℃，10000g下离心1min，扔掉中心柱，将所提取的DNA保存在-20℃中。2.4.4.2荧光定量PCR①荧光定量PCR分析采用IQ5real-timePCRsystem（Bio-RadLab，LA，USA）。假单胞菌：20µLPCR反应体系为，2.5µL模板，0.3µL（10mM）引物PSF/PSR[82]，9µL2×RealSYBRMixture（天根），7.9µL去离子水。反应程序：95℃预变性5min，95℃变性50s，63℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃终延伸10min；83℃读取荧光数据。为了排除外源DNA污染所导致的实验误差，在实验过程中设置阴性对照，即将模板DNA替换成等量的去离子水。最后，使用琼脂糖凝胶电泳检测PCR的最终产物，琼脂糖的浓度为1%，如若检测结果为单一的目的条带，说明试验结果可用。其扩增片段长度990bp。14 材料与方法PSF5’-GGTCTGAGAGGATGATCAGT-3’PSR5’-TTAGCTCCACCTCGCGGC-3’西瓜专化型尖孢镰刀菌：采用巢式PCR，引物为ITSF1/ITS4和Fn-1/Fn-2[83]。第一轮为：20μLPCR反应体系，1.5μL模板，0.3μL引物ITSF1/ITS4，10μLPCRMix，7.9μL去离子水，反应条件为94℃预变性5min，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，25个循环，72℃延伸7min；第二轮为20μLPCR反应体系，1.5μL模板（上一轮PCR产物），0.5μL引物Fn-1/Fn-2，10μL2×RealSYBRMixture（TIANGEN），7.9μL去离子水，94℃预变性5min，94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸30s，28个循环，72℃延伸10min，83℃读板。为了排除外源DNA污染所导致的实验误差，在实验过程中设置阴性对照，即将模板DNA替换成等量的去离子水。最后，使用琼脂糖凝胶电泳检测PCR的最终产物，琼脂糖的浓度为1%，如若检测结果为单一的目的条带，说明试验结果可用。其扩增片段为327bp。引物Fn-1/Fn-2序列如下，Fn-15’-TACCACTTGTTGCCTCGGC-3’Fn-25’-TTGAGGAACGCGAATTAAC-3’②标准曲线的绘制提取样品中的假单胞菌，西瓜专化型尖孢镰刀菌的质粒，分别将其质粒作为模板制备标准曲线。质粒的提取方法：先用土壤DNA为模板进行PCR扩增，再对目的条带进行胶回收，经过基因纯化、连接载体转化，挑选蓝白斑进行阳性克隆培养等一系列过程，最终获得目的基因的质粒，并用核酸检测仪测定质粒的浓度。将重组质粒DNA稀释成一系列浓度（100ng·μL-1~1fg·μL-1）的标准样品并贮存于-20℃备用。将质粒浓度（ng·μL-1）换算成模板拷贝数浓度（CN），公式如下：CN=（6.02×1023×核酸浓度×10-9）/（DNAlength×660）copies/µL0.25g土中提取100µLDNA，因此每克干土中待测微生物的数量为：［（6.02×1023×核酸浓度×10-9）/（DNAlength×660）］×400/（1-含水量）copies/g土2.4.4.3土壤微生物MiSeq测序土壤细菌和真菌的MiSeq测序交由上海美吉生物公司完成。①土壤DNA的提取同2.4.4.1；②PCR扩增：细菌引物为515F/907R，真菌引物为ITS1F/2043R。两者均为20µL的反应体系：4µL5×FastPfuBuffer，2µL2.5mMdNTPs，0.8µL引物（5µM），0.4µL聚合酶，10ng土壤DNA，0.2µLBSA，用ddH2O补充至20µL。细菌的反应程序为95℃预变性3min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，27个循环，72℃延伸10min；真菌的反应程序为95℃预变性3min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环，72℃延伸10min。③MiSeq测序PCR产物经过PCR纯化试剂盒纯化和核酸定量后，由美吉公司上机测序。15 东北农业大学农学硕士学位论文2.5数据分析原始数据处理采用officeexcle2010；数据分析使用SAS9.0版，方差分析采用Turkey’sHSD，在p<0.05水平下分析；图表分析使用Origin8.5。使用Usearch（version7.1）按照97%的相似性对非重复序列（不含单序列）进行OTU聚类，细菌，真菌分别使用Silva，Unite数据库进行比对；利用Mother（versionv.1.30.1）软件评估OTU相似水平97%的多样性指数分析，检验方法为Student’sT检验；利用R语言进行Venn图，NMDS的制作分析，NMDS采用bray-curtis的距离算法；使用分析软件LEfSe进行多级物种差异判别分析，使用Kruskal-Wallis秩和检验的检验方法，fdr多重检验校正分析组间差异性。16 结果与分析3结果与分析3.1小麦伴生对西瓜生长的影响3.1.1水培条件下小麦伴生对西瓜生物量的影响由图3-1可知，水培条件下，西瓜单作的地下鲜重和地上干重显著地高于小麦伴生西瓜的地下鲜重和地上干重，而两者之间的地上鲜重和地下干重差异不显著。注：M：西瓜单作；C：小麦伴生西瓜Note:Mwatermelonmonoculture;Cwatermeloncompanionwithwheat图3-1水培条件下小麦伴生对西瓜生物量的影响Fig.3-1Effectonthebiomassofwatermelonwithcompanionwheatunderhydroponiccondition3.1.2水培接菌条件下小麦伴生对西瓜生物量的影响从图3-2可以看出，在水培接菌的条件下，伴生对地下部产生了显著的影响。与单作相比，伴生显著提高了西瓜地下部干鲜重，而两者之间的地上部分干鲜重差异不显著。17 东北农业大学农学硕士学位论文注：M+F：西瓜单作接菌；C+F：小麦伴生西瓜接菌Note:MwatermelonmonocultureunderinoculationFON;CwatermelonwithcompanionwheatunderinoculationFON图3-2水培接菌条件下小麦伴生对西瓜生长的影响Fig.3-2Effectonthebiomassofwatermelonwithcompanionwheatunderhydroponicinoculationconditions3.1.3盆栽条件下小麦伴生及接菌对西瓜生长的影响由图3-3可知，在接菌条件下，伴生显著改变了西瓜的生长。与处理A+F相比，处理A1+F，A1+Fw显著的增加植株的干鲜重，而处理A1+F和处理A1+Fw两者之间的植株干鲜重差异不显著。18 结果与分析注：A+F：西瓜分根单作接菌；A1+F：西瓜分根伴生无小麦侧接菌；A1+Fw：西瓜分根伴生有小麦侧接菌Note:A+F:watermelonofspilt-rootmonocultureandinoculationFON(onesideofwatermelon);A1+F:watermelonofsplit-root/wheatcompanion(oneside)andinoculationFON(withoutwheatside);A1+Fw:watermelonofsplit-root/wheatcompanion(oneside)andinoculationwithFON(wheatside)图3-3接菌条件下小麦伴生对西瓜生长的影响Fig.3-3EffectonthebiomassofwatermelonwithcompanionwheatunderinoculationFON3.2小麦伴生对西瓜枯萎病的影响3.2.1水培条件小麦伴生对西瓜枯萎病的影响由图3-4可知，小麦伴生西瓜和西瓜单作的枯萎病发病率之间差异不显著，但伴生显著降低了西瓜枯萎病的病情指数，降低了16.66。19 东北农业大学农学硕士学位论文注：M+F：西瓜单作接菌；C+F：小麦伴生西瓜接菌Note:M+FwatermelonmonocultureunderinoculationFON;C+FwatermelonwithcompanionwheatunderinoculationFON图3-4水培条件下小麦伴生对西瓜枯萎病发病率和病情指数的影响Fig.3-4EffectonwatermelonFusariumwiltofincidenceofdiseaseanddiseaseindexwithcompanionwheatunderhydroponiccondition3.2.2盆栽条件下小麦伴生对西瓜枯萎病的影响如图3-5所示，A+F，A1+F，A1+Fw三个处理两两之间的西瓜枯萎病发病率差异不显著。但与处理A+F相比，处理A1+F和A1+Fw显著降低了西瓜枯萎病的病情指数，分别降低了11.25，14.12；而处理A1+F和A1+Fw之间的病情指数差异不显著。说明伴生能够降低枯萎病的病情指数，但有无小麦的存在对其病情指数的影响无显著差异。20 结果与分析注：A+F：西瓜分根单作接菌；A1+F：西瓜分根伴生无小麦侧接菌；A1+Fw：西瓜分根伴生有小麦侧接菌Note:A+F:watermelonofspilt-rootmonocultureandinoculationFON(onesideofwatermelon);A1+F:watermelonofsplit-root/wheatcompanion(oneside)andinoculationFON(withoutwheatside);A1+Fw:watermelonofsplit-root/wheatcompanion(oneside)andinoculationFON(wheatside);图3-5小麦伴生对西瓜枯萎病发病率和病情指数的影响Fig.3-5EffectonwatermelonFusariumwiltofincidenceofdiseaseanddiseaseindexwithcompanionwheat3.3小麦伴生西瓜根系分泌物对西瓜枯萎病病原菌的影响3.3.1水培条件下小麦伴生西瓜根系分泌物对西瓜枯萎病病原菌的影响与对照相比，单作和伴生的西瓜分泌物显著地抑制了尖孢镰刀菌菌落的生长；与单作相比，伴生的西瓜分泌物亦是显著地抑制了尖孢镰刀菌菌落的生长，抑制率为8.8%。与对照相比，单作西瓜的根系分泌物显著地促进了尖孢镰刀菌孢子的萌发，而伴生西瓜的根系分泌物显著地抑制了尖孢镰刀菌孢子的萌发；与单作相比，伴生西瓜根系分泌物显著的抑制了尖孢镰刀菌孢子的萌发，抑制率为62.2%（图3-6）。21 东北农业大学农学硕士学位论文注：CK：甲醇；M：西瓜单作；C：小麦伴生西瓜Note:CKmethanol;Mwatermelonmonoculture;Cwatermelonwithcompanionwheat图3-6小麦伴生西瓜根系分泌物对尖孢镰刀菌的菌落生长及孢子萌发的影响Fig.3-6EffectofwatermelonrootexudatesoncolonydiameterandsporegerminationrateofFONwithcompanionwheat3.3.2水培接菌的条件下小麦伴生西瓜根系分泌物对西瓜枯萎病病原菌的影响接菌条件下，与对照相比，单作和伴生的西瓜分泌物显著地抑制了尖孢镰刀菌菌落的生长；与单作相比，伴生的西瓜分泌物亦是显著地抑制了尖孢镰刀菌菌落的生长，抑制率为7.1%。与对照相比，单作西瓜的根系分泌物显著地促进了尖孢镰刀菌孢子的萌发，而伴生西瓜的根系分泌物显著地抑制低了尖孢镰刀菌孢子的萌发；与单作相比，伴生西瓜根系分泌物显著的抑制了尖孢镰刀菌孢子的萌发，抑制率为32.9%（图3-7）。22 结果与分析注：CK：甲醇；M+F：单作接菌；C+F：小麦伴生西瓜接菌Note:CKmethanol;M+FwatermelonmonocultureunderinoculationFON;C+FwatermelonwithcompanionwheatunderinoculationFON图3-7接菌后小麦伴生西瓜根系分泌物对尖孢镰刀菌的菌落生长和孢子萌发的影响Fig.3-7EffectofwatermelonrootexudatesoncolonydiameterandsporegerminationrateofFONwithcompanionwheatunderinoculationFON3.4小麦伴生及其根系分泌物对土壤假单胞菌和西瓜专化型尖孢镰刀菌菌群丰度的影响3.4.1伴生西瓜根系分泌物对土壤假单胞菌和西瓜专化型尖孢镰刀菌菌群丰度的影响由图3-8a可知，各处理之间的假单胞菌菌群丰度差异不显著，说明伴生西瓜根系分泌物对土壤假单胞菌菌群丰度无影响。由于本实验中采用巢式PCR分析西瓜专化型尖孢镰刀菌菌群丰度，所以结果不能真实的反应土壤中西瓜专化型尖孢镰刀菌菌群的真实丰度，但可以代表不同处理之间菌群的相对丰度。从图3-8b可以看出，不同处理之间的西瓜专化型尖孢镰刀菌的菌群的相对丰度差异不显著。23 东北农业大学农学硕士学位论文a)b)注：CK：对照；M：西瓜单作；C：小麦伴生西瓜Note:CK:controlblank;M:watermelonmonoculture;C:watermelonwithcompanionwheat图3-8伴生西瓜根系分泌物对土壤假单胞菌（a）和西瓜专化型尖孢镰刀菌（b）菌群丰度的影响Fig.3-8EffectofwatermelonrootexudatesonsoilPseudomonas(a)andFusarium(b)populationabundancewithcompanionwheat3.4.2小麦伴生西瓜对土壤假单胞菌和西瓜专化型尖孢镰刀菌菌群丰度的影响由图3-9a可知，处理MF，CF，CWF两两之间，处理MU，CU，CWU两两之间的假单胞菌的群落丰度差异不显著；MF与MU之间，以及处理CF，CWU，CU，CWF相互之间的假单胞菌的群落丰度差异不显著；处理CWU假单胞菌的群落丰度显著高于处理MF。由于本实验中采用巢式PCR分析西瓜专化型尖孢镰刀菌菌群丰度，所以结果不能真实的反应土壤中西瓜专化型尖孢镰刀菌菌群的真实丰度，但可以代表不同处理之间菌群的相对丰度。由图3-9b可知，与处理MF，CF相比，处理CWF显著降低了西瓜专化型尖孢镰刀菌菌群的相对丰度，而处理MF与CF之间菌群相对丰度差异不显著；处理MU，CU，CWU两两之间的菌群的相对丰度差异不显著；与处理MF相比，MU显著降低了菌群的相对丰度，与处理CF相比，CU显著降低了菌群的相对丰度，而处理CWF和CWU的菌群相对丰度差异不显著。说明小麦能够影响西瓜专化型尖孢镰刀菌菌群丰度。24 结果与分析b)a)注：MU西瓜单作未接菌侧；MF西瓜单作接菌侧；CF小麦伴生西瓜无小麦侧接菌；CWU小麦伴生西瓜有小麦侧未接菌；CU小麦伴生西瓜无小麦侧未接菌；CWF小麦伴生西瓜有小麦侧接菌Note:MUwatermelonofspilt-rootmonocultureandnon-inoculationwithFON;MFwatermelonofspilt-rootmonocultureandinoculatedwithFON;CFwatermelonofspilt-root(oneside)/wheatcompanionandinoculationwithFON(non-wheatside);CWUwatermelonofspilt-root(oneside)/wheatcompanionandnon-inoculationwithFON(wheatside);CUwatermelonofspilt-root(oneside)/wheatcompanionandnon-inoculationwithFON(non-wheatside);CWFwatermelonofspilt-root(oneside)/wheatcompanionandinoculatedwithFON(wheatside)图3-9小麦伴生西瓜对土壤假单胞菌（a）和西瓜专化型尖孢镰刀菌（b）菌群丰度的影响Fig.3-9EffectofwatermelonwithcompanionwheatonsoilPseudomonas(a)andFusarium(b)populationabundanceofwatermelonrhizosphere3.5小麦伴生西瓜对土壤微生物菌群分布和多样性的影响3.5.1小麦伴生西瓜对土壤真菌和细菌菌群分布的影响运用MiSeq高通量技术测定了不同处理方式下西瓜根际细菌16SDNA的V3-V4区和真菌ITS的ITS2区，分析了细菌和真菌在门水平和属水平的种群结构差异，比较了不同处理的细菌和真菌的丰富度和多样性，并进行了非度量多维尺度（NMDS）、Venn图、物种差异分析。由图3-10a可知，在门水平上，所测得的序列分属于细菌的37个门，主要有25 东北农业大学农学硕士学位论文Proteobacteria（变形菌门），Bacteroidetes（拟杆菌门），Actinobacteria（放线菌门），Acidobacteria（酸杆菌门），Cyanobacteria（蓝菌门），Chloroflexi（绿弯菌门），各处理中此六种菌门的序列总和均占全部序列的84%以上，这些为优势菌群。其中处理CWU的拟杆菌门的相对百分丰度高于其它的处理（除处理CWF外），为20.49%；处理CWU的酸杆菌门的相对百分丰度分别为6.051%，均低于其它处理（除处理CF外）（图3-11a）。所测得的真菌序列分属于4个真菌门水平（图3-10b），主要有Chytridiomycota（壶菌门），Ascomycota（子囊菌门），Zygomycota（接合菌门），Basidiomycota（担子菌门）。其中处理MF的担子菌门的相对百分丰度为6.23%，高于伴生的各处理的相对百分丰度；伴生各处理在各类真菌菌门的相对百分丰度变化不大。在属水平上，处理MU和处理MF的细菌和真菌群落的组成基本相似。细菌属主要有norank_c_Cyanobacteria，norank_o_Subgroup_6，Novosphingobium（新鞘氨醇杆菌属），Ohtaekwangia，Flavobacterium（单黄菌属），norank_f_RB41，Lysobacter（溶杆菌属），Pseudomonas（假单胞菌），Streptomyces（链霉菌属），uncultureed_f_Nitrosomonadaceae（未分类的亚硝化单胞菌科），Cellvibrio（纤维弧菌属），uncultured_f_Anaerolineaceae，uncultured_Gemmatimonadacea（e未分类的芽单胞菌科），uncultured_o_Gaiellale（s图3-12a）。在细菌属水平上，与处理MF和CF相比，处理CWF提高了Devosia的相对百分丰度（p=0.017），处理MF和CF的群落相对百分丰度无差异（p>0.05）。与处理MU相比，处理CWU提高了Devosia，Dyadobacter，Luteimonas，Lysobacter的相对百分丰度（p=0.017，p=0.047，p=0.021，p=0.046），同时降低了norank_o_Subgroup_6，Haliangium，Rhodoplanes，norank_f_RB41（p=0.016，p=0.026，p=0.015，p=0.040）的相对百分丰度；处理MU和处理CU的群落相对百分丰度无差异（p>0.05）。而处理MU和处理MF，处理CU和处理CF，处理CWU和处理CWF之间的群落相对百分丰度无差异（p>0.05）（图3-13a）。说明小麦影响了细菌属水平的群落相对百分丰度。真菌属水平上，伴生分根系统中不同处理间在群落组成上相似。与处理MF相比，处理CF提高了Olpidium（油壶菌属）的相对百分丰度（p=0.043），处理CF和CWF均降低了Nectriaceae_unclassified（未分类的丛赤壳科）的相对百分丰度（p=0.036，p=0.012）（图3-11b，3-12b）。通过对镰孢菌属的Kruskal-Wallis秩和检验可知，与处理MF相比，其他各处理均显著地降低了镰孢菌属的相对百分丰度，其中处理CWU，CWF，MU达到了极显著地水平；而伴生各处理间无显著的差异（图3-14）。26 结果与分析a)b)注：MU西瓜单作未接菌侧；MF西瓜单作接菌侧；CF小麦伴生西瓜无小麦侧接菌；CWU小麦伴生西瓜有小麦侧未接菌；CU小麦伴生西瓜无小麦侧未接菌；CWF小麦伴生西瓜有小麦侧接菌Note:MUwatermelonofspilt-rootmonocultureandnon-inoculationwithFON;MFwatermelonofspilt-rootmonocultureandinoculatedwithFON;CFwatermelonofspilt-root(oneside)/wheatcompanionandinoculationwithFON(withoutwheatside);CWUwatermelonofspilt-root(oneside)/wheatcompanionandnon-inoculationwithFON(wheatside);CUwatermelonofspilt-root(oneside)/wheatcompanionandnon-inoculationwithFON(withoutwheatside);CWFwatermelonofspilt-root(oneside)/wheatcompanionandinoculatedwithFON(wheatside)图3-10小麦伴生对西瓜根际细菌（a）和真菌（b）类群门水平上的影响Fig.3-10Effectoftherhizosphereofwatermelonwithcompanionwheatonsoilbacterial(a)andfungal(b)taxadistributionatphylumlevel27 东北农业大学农学硕士学位论文图3-11小麦伴生对西瓜根际细菌（a）和真菌（b）类群门水平上某些菌群的影响Fig.3-11Effectoftherhizosphereofwatermelonwithcompanionwheatonsomeofsoilbacterial(a)andfungal(b)taxadistributionatphylumlevel28 结果与分析a)b)注：MU西瓜单作未接菌侧；MF西瓜单作接菌侧；CF小麦伴生西瓜无小麦侧接菌；CWU小麦伴生西瓜有小麦侧未接菌；CU小麦伴生西瓜无小麦侧未接菌；CWF小麦伴生西瓜有小麦侧接菌Note:MUwatermelonofspilt-rootmonocultureandnon-inoculationwithFON;MFwatermelonofspilt-rootmonocultureandinoculatedwithFON;CFwatermelonofspilt-root(oneside)/wheatcompanionandinoculatedwithFON(non-wheatside);CWUwatermelonofspilt-root(oneside)/wheatcompanionandnon-inoculationwithFON(wheatside);CUwatermelonofspilt-root(oneside)/wheatcompanionandnon-inoculationwithFON(non-wheatside);CWFwatermelonofspilt-root(oneside)/wheatcompanionandinoculatedwithFON(wheatside)图3-12小麦伴生对西瓜根际细菌（a）和真菌（b）类群属水平上的影响Fig.3-12Effectoftherhizosphereofwatermelonwithcompanionwheatonsoilbacterial(a)andfungal(b)taxadistributionatgenuslevel29 东北农业大学农学硕士学位论文图3-13小麦伴生对西瓜根际细菌（a）和真菌（b）类群属水平上某些菌群的影响Fig.3-13Effectoftherhizosphereofwatermelonwithcompanionwheatonsomeofsoilbacterial(a)andfungal(b)taxadistributionatgenuslevel30 结果与分析注：MU西瓜单作未接菌侧；MF西瓜单作接菌侧；CF小麦伴生西瓜无小麦侧接菌；CWU小麦伴生西瓜有小麦侧未接菌；CU小麦伴生西瓜无小麦侧未接菌；CWF小麦伴生西瓜有小麦侧接菌Note:MUwatermelonofspilt-rootmonocultureandnon-inoculationwithFON;MFwatermelonofspilt-rootmonocultureandinoculatedwithFON;CFwatermelonofspilt-root(oneside)/wheatcompanionandinoculatedwithFON(non-wheatside);CWUwatermelonofspilt-root(oneside)/wheatcompanionandnon-inoculationwithFON(wheatside);CUwatermelonofspilt-root(oneside)/wheatcompanionandnon-inoculationwithFON(non-wheatside);CWFwatermelonofspilt-root(oneside)/wheatcompanionandinoculatedwithFON(wheatside)图3-14不同处理下镰刀菌属的Kruskal-Wallis秩和检验图Fig.3-14Kruskal-WallisHtestbarplotongenuslevelofFusariumunderdifferenttreatment图3-15，图3-16是对细菌，真菌群落的LEfse多级物种差异判别分析，LEfse算法强调了统计意义和生物相关性，能够识别不同丰度的特征以及相关联的类别。圆圈代表不同的分类水平，从内到外依次为门、纲、目、科、属。图中黄色的点代表各处理之间无显著差异，其他颜色的各点代表该处理在此分类水平上的菌群具有重要作用。最外层圆圈上的字母代表具有显著差异的属水平上的菌群。由图3-15可知，处理CWU在细菌属水平上丰富的菌群为Lysobacter，Luteimonas，Phenylobacterium，Devosia，Dyadobacter，Arcticibacter；处理CWF在细菌属水平上丰富的菌群为Sphingobium，Brevundimonas，Shinella，Pedobacter，norank_o_Chthonomonadales；处理MF在细菌属水平上丰富的菌群为Nitrospira，uncultured_f_Solimonadaceae，Rhodoplanes，Candidatus_Entotheonella，Microlunatus，norank_o_Subgroup_6，Roseiflexus。由图3-1631 东北农业大学农学硕士学位论文可知，在真菌的属水平上，较为丰富的菌群属于单作处理，如unclassified_f_Nectriaceae，Fusarium，Leptosphaeria，Meyerozyma。注：MU西瓜单作未接菌侧；MF西瓜单作接菌侧；CF小麦伴生西瓜无小麦侧接菌；CWU小麦伴生西瓜有小麦侧未接菌；CU小麦伴生西瓜无小麦侧未接菌；CWF小麦伴生西瓜有小麦侧接菌Note:MUwatermelonofspilt-rootmonocultureandnon-inoculationwithFON;MFwatermelonofspilt-rootmonocultureandinoculatedwithFON;CFwatermelonofspilt-root(oneside)/wheatcompanionandinoculatedwithFON(non-wheatside);CWUwatermelonofspilt-root(oneside)/wheatcompanionandnon-inoculationwithFON(wheatside);CUwatermelonofspilt-root(oneside)/wheatcompanionandnon-inoculationwithFON(non-wheatside);CWFwatermelonofspilt-root(oneside)/wheatcompanionandinoculatedwithFON(wheatside)图3-15细菌群落的LEfSe多级物种层级树图Fig.3-15LEfsecladogramofsoilbacterialcommunity32 结果与分析注：MU西瓜单作未接菌侧；MF西瓜单作接菌侧；CF小麦伴生西瓜无小麦侧接菌；CWU小麦伴生西瓜有小麦侧未接菌；CU小麦伴生西瓜无小麦侧未接菌；CWF小麦伴生西瓜有小麦侧接菌Note:MUwatermelonofspilt-rootmonocultureandnon-inoculationwithFON;MFwatermelonofspilt-rootmonocultureandinoculatedwithFON;CFwatermelonofspilt-root(oneside)/wheatcompanionandinoculatedwithFON(non-wheatside);CWUwatermelonofspilt-root(oneside)/wheatcompanionandnon-inoculationwithFON(wheatside);CUwatermelonofspilt-root(oneside)/wheatcompanionandnon-inoculationwithFON(non-wheatside);CWFwatermelonofspilt-root(oneside)/wheatcompanionandinoculatedwithFON(wheatside)图3-16真菌群落的LEfSe多级物种层级树图Fig.3-16LEfsecladogramofsoilfungalcommunity非度量多维尺度分析（NMDS）是一种对研究对象进行降维后能够保证对象间原始关系不变的数据分析方法。它是先将研究对象的多维空间简化到低维空间，然后在低维空间对研究对象再进行定位、分析和归类。该分析适用于分析那些无法得到样本间精确的相似性或相异性的数据，仅能知道它们之间等级关系数据的情形。它是根据样本中包含的物种信息的特点，并将其以点的形式映射在多维空间上，利用点与点间的距离来反应不同样本间的差异程度，具体体现在点与点之间的距离越近，则群落结构差异越小，反之亦然。从图3-17a可以看出，处理MU和CWU，处理MU和CU之前的距离较远，表明它们之间的细菌群落结构差异较大，而处理MU和MF之间，处理MF和CF之间，CU，CWF，CF，CWU相互之间的距离较近，因此它们的的群落结构差异较小。由图3-17b可知，处理MF和处理CWF之间的距离较远，它们之间的真菌群落差异较大。说明小麦对微生物的群落33 东北农业大学农学硕士学位论文影响较大。a)b)注：MU西瓜单作未接菌侧；MF西瓜单作接菌侧；CF小麦伴生西瓜无小麦侧接菌；CWU小麦伴生西瓜有小麦侧未接菌；CU小麦伴生西瓜无小麦侧未接菌；CWF小麦伴生西瓜有小麦侧接菌Note:MUwatermelonofspilt-rootmonocultureandnon-inoculationwithFON;MFwatermelonofspilt-rootmonocultureandinoculatedwithFON;CFwatermelonofspilt-root(oneside)/wheatcompanionandinoculatedwithFON(non-wheatside);CWUwatermelonofspilt-root(oneside)/wheatcompanionandnon-inoculationwithFON(wheatside);CUwatermelonofspilt-root(oneside)/wheatcompanionandnon-inoculationwithFON(non-wheatside);CWFwatermelonofspilt-root(oneside)/wheatcompanionandinoculatedwithFON(wheatside)图3-17小麦伴生西瓜根际细菌（a）和真菌（b）NMDS分析Fig.3-17NMDSanalysisofsoilbacterial(a)andfungal(b)ofthewatermelonrhizospherewithcompanionwheat34 结果与分析图3-18反映了不同处理土壤样品间细菌共同或独自的OTU数目，直观的表达了样品中OTU数目的相似性和重叠情况。处理MF，CF，CWF所共有的OTU数目是2355，分别独有的OTU数目为110，87，109；处理MF，CF共有的OTU数目是2582，处理MF，CWF共有的OTU数目是2538，处理CF，CWF共有的OTU数目是2511。在属水平上，三个处理共有的OTU序列主要属于Cyanobacteria，处理MF，CF，CWF独有的OTU序列分别主要属于Saccharopolyspora（11.34%），Idiomarina（55.32%），Sporolactobacillaceae（19.23%）（附录图A-1）。处理MU，CU，CWU所共有的OTU数目是2231，分别独有的OTU数目为157，85，107；处理MU，CU共有的OTU数目是2499，处理MU，CWU共有的OTU数目是2445，处理CU，CWU共有的OTU数目是2358。在属水平上，三个处理共有的OTU序列主要属于Cyanobacteria，处理MU，CU，CWU独有的OTU序列分别主要属于Bacilli（23.68%），Hirschia（32.43%），Chthoniobacter（23.3%）（附录图A-3）。由图3-19可知，处理MF，CF，CWF所共有的真菌OTU数目是152，分别独有的OTU数目为99，18，20；处理MF，CF共有的OTU数目是196，处理MF，CWF共有的OTU数目是188，处理CF，CWF共有的OTU数目是165。在属水平上，三个处理共有的OTU序列主要属于Olpidiaster，处理MF，CF，CWF独有的OTU序列分别主要属于Typhula（62.37%），Coniochaeta（70%），Vermispora（35.85%）（附录图A-2）。处理MU，CU，CWU所共有的OTU数目是169，分别独有的OTU数目为53，26，20；处理MU，CU共有的OTU数目是222，处理MU，CWU共有的OTU数目是207，处理CU，CWU共有的OTU数目是182。在属水平上，三个处理共有的OTU序列主要属于Olpidiaster，处理MU，CU，CWU独有的OTU序列分别主要属于Tuber（44.26%），Ascobolaceae（55.02%），Ceratobasidiaceae（87.36%）（附录图A-4）。35 东北农业大学农学硕士学位论文MUCWUCUMFCFCWF注：MU西瓜单作未接菌侧；MF西瓜单作接菌侧；CF小麦伴生西瓜无小麦侧接菌；CWU小麦伴生西瓜有小麦侧未接菌；CU小麦伴生西瓜无小麦侧未接菌；CWF小麦伴生西瓜有小麦侧接菌Note:MUwatermelonofspilt-rootmonocultureandnon-inoculationwithFON;MFwatermelonofspilt-rootmonocultureandinoculatedwithFON;CFwatermelonofspilt-root(oneside)/wheatcompanionandinoculatedwithFON(non-wheatside);CWUwatermelonofspilt-root(oneside)/wheatcompanionandnon-inoculationwithFON(wheatside);CUwatermelonofspilt-root(oneside)/wheatcompanionandnon-inoculationwithFON(non-wheatside);CWFwatermelonofspilt-root(oneside)/wheatcompanionandinoculatedwithFON(wheatside)图3-18小麦伴生西瓜根际细菌OTU分布Venn图Fig.3-18VenndiagramanalysisofsoilbacterialOTUofthewatermelonrhizospherewithcompanionwheat36 结果与分析MUCWUCUMFCFCWF注：MU西瓜单作未接菌侧；MF西瓜单作接菌侧；CF小麦伴生西瓜无小麦侧接菌；CWU小麦伴生西瓜有小麦侧未接菌；CU小麦伴生西瓜无小麦侧未接菌；CWF小麦伴生西瓜有小麦侧接菌Note:MUwatermelonofspilt-rootmonocultureandnon-inoculationwithFON;MFwatermelonofspilt-rootmonocultureandinoculatedwithFON;CFwatermelonofspilt-root(oneside)/wheatcompanionandinoculatedwithFON(non-wheatside);CWUwatermelonofspilt-root(oneside)/wheatcompanionandnon-inoculationwithFON(wheatside);CUwatermelonofspilt-root(oneside)/wheatcompanionandnon-inoculationwithFON(non-wheatside);CWFwatermelonofspilt-root(oneside)/wheatcompanionandinoculatedwithFON(wheatside)图3-19小麦伴生西瓜根际真菌OTU分布Venn图Fig.3-19VenndiagramanalysisofsoilfungalOTUofthewatermelonrhizospherewithcompanionwheat37 东北农业大学农学硕士学位论文3.5.2小麦伴生西瓜对土壤真菌和细菌群落多样性的影响Sobs指数反映群落的丰富度；Simpson-even指数反应群落的均匀度；Shannon指数反应群落的多样性，Shannon数越大，群落的多样性越高。由表3-1可知，各处理的Sobs指数之间差异不显著，说明它们之间的细菌群落丰富度没有差异。与处理MU相比，处理CWU显著降低了细菌的Shannon指数，而处理MU和CU，处理CU和CWU之间，以及MF，CF，CWF相互之间的差异不显著，说明处理CWU降低了细菌群落的多样性。处理MF，CF，CWF之间，处理MU，CU，CWU之间，处理MF和MU之间，以及处理CU，CF，CWU，CWF相互之间的Simpson-even指数无显著差异，说明伴生，接菌对细菌群落的均匀度无影响。表3-1小麦伴生对西瓜根际土壤细菌多样性的影响（相似度在97%的水平下）Tab.3-1Effectofwatermelonwithcompanionwheatonthebacterialcommunity（atthecutofflevelof3%）处理细菌群落TreatmentBacterialcommunitySobsShannonSimpson-evenMF2198.67±85.80a6.35±0.14a0.07±0.02abMU2188.00±105.53a6.34±0.11a0.07±0.01abCF2118.33±93.39a6.30±0.07a0.08±0.01aCWU1949.00±116.20a5.91±0.23b0.05±0.01bCU1970.33±127.63a6.01±0.11ab0.05±0.01abCWF2082.00±54.44a6.21±0.13ab0.08±0.01ab注：MU西瓜单作未接菌侧；MF西瓜单作接菌侧；CF小麦伴生西瓜无小麦侧接菌；CWU小麦伴生西瓜有小麦侧未接菌；CU小麦伴生西瓜无小麦侧未接菌；CWF小麦伴生西瓜有小麦侧接菌。p<0.05Note:MUwatermelonofspilt-rootmonocultureandnon-inoculationwithFON;MFwatermelonofspilt-rootmonocultureandinoculatedwithFON;CFwatermelonofspilt-root(oneside)/wheatcompanionandinoculatedwithFON(non-wheatside);CWUwatermelonofspilt-root(oneside)/wheatcompanionandnon-inoculationwithFON(wheatside);CUwatermelonofspilt-root(oneside)/wheatcompanionandnon-inoculationwithFON(non-wheatside);CWFwatermelonofspilt-root(oneside)/wheatcompanionandinoculatedwithFON(wheatside).p<0.05由表3-2可知，与处理MF相比，处理CWF显著降低了Sobs指数，而其他各处理之间的Sobs指数差异不显著，说明处理CWF可以降低真菌群落的丰富度。与处理MF相比，处理CF和CWF显著降低了真菌的Shannoon指数，而处理CF和CWF之间，处理MU，CU，CWU相互之间，处理MF和MU，以及处理CU，CF，CWU，CWF相互之间的差异不显著，说明处理CF和CWF降低了真菌的多样性。各处理之间的Simpson-even指数无显著差异，表明伴生，接菌对真菌群落的均匀度无影响。由此可以表明，接菌条件对土壤38 结果与分析微生物的多样性无影响，而小麦可以影响土壤微生物的多样性。表3-2小麦伴生对西瓜根际土壤真菌多样性的影响（相似度在97%的水平下）Tab.3-2Effectofwatermelonwithcompanionwheatonthefungalcommunity（atthecutofflevelof3%）处理真菌群落TreatmentFungalcommunitySobsShannonSimpson-evenMF240.00±18.73a2.53±0.36a0.024±0.002aMU207.67±55.19ab1.99±0.71ab0.023±0.007aCF149.33±26.31ab1.15±0.13b0.013±0.004aCWU149.67±35.83ab1.20±0.20b0.017±0.004aCU178.33±34.82ab1.53±0.56ab0.017±0.005aCWF145.00±20.22b1.24±0.27b0.0167±0.002a注：MU西瓜单作未接菌侧；MF西瓜单作接菌侧；CF小麦伴生西瓜无小麦侧接菌；CWU小麦伴生西瓜有小麦侧未接菌；CU小麦伴生西瓜无小麦侧未接菌；CWF小麦伴生西瓜有小麦侧接菌。p<0.05Note:MUwatermelonofspilt-rootmonocultureandnon-inoculationwithFON;MFwatermelonofspilt-rootmonocultureandinoculatedwithFON;CFwatermelonofspilt-root(oneside)/wheatcompanionandinoculatedwithFON(non-wheatside);CWUwatermelonofspilt-root(oneside)/wheatcompanionandnon-inoculationwithFON(wheatside);CUwatermelonofspilt-root(oneside)/wheatcompanionandnon-inoculationwithFON(non-wheatside);CWFwatermelonofspilt-root(oneside)/wheatcompanionandinoculatedwithFON(wheatside).p<0.0539 东北农业大学农学硕士学位论文4讨论4.1小麦伴生对西瓜生长及病害的影响大量的研究表明间套作是一种促进植物生长，缓解病害的有效栽培措施，因为不同的作物种植时，既可以优化养分的分配，平衡土壤中养分的含量，又能高效地利用植物的生长空间，因而能够促进植物的生长，还能够有效的控制某些病害的产生[84-86]。与黄瓜单作相比，黄瓜套种分蘖洋葱显著增加了植株全株的干重[87]；大葱伴生番茄显著增加了番茄的产量[88]；西瓜与辣椒间作的地上部鲜重显著优于西瓜单作[89]。这与本实验中在接菌的条件下，小麦伴生西瓜显著增加了植株的干鲜重，以及水培条件下，接菌后小麦伴生西瓜显著增加了西瓜的地下干鲜重相一致。而水培条件下，接菌前后小麦伴生对西瓜生长影响的不同，可能原因是本实验采用了分根的方法，分根影响了根系生长[90]，削弱了伴生起的促进生长作用，又由于采用了营养液栽培，小麦和西瓜的生长存在营养竞争，使得单作的地上干重高于伴生；而在病原菌存在下，西瓜单作受到病原菌的侵害，影响了西瓜的生长，小麦伴生则对西瓜的生长起到了保护作用，维持了它的正常生长。玉米与大豆，高粱与大豆间作，可以有效地延缓大豆细菌性枯萎病的发病时间，降低它的发病率，从而促进植物的生长[91]；小麦与蚕豆间作对于蚕豆枯萎病起到了良好的防治效果[24]；西瓜与旱稻间作体系中的西瓜枯萎病的发病率显著低于西瓜单作处理[92]。本实验的结果与他们的研究结果相一致，小麦伴生西瓜降低了西瓜枯萎病的病情指数，说明小麦伴生缓解了西瓜的枯萎病病害，有利于西瓜的生长。4.2根系分泌物对西瓜枯萎病病原菌的影响根系分泌物既能为微生物的生长和繁殖提供能源，也可以通过产生化感物质直接对病原菌的生长产生影响，阻止病害的发生。郝文雅[93-94]通过对西瓜和水稻的根系分泌物的研究发现，西瓜的根系分泌物能够促进枯萎病病原菌孢子的萌发及产孢，而水稻根系分泌物对其的作用则与之相反；Hage[95]的研究发现，番茄同时接种AMF和FON后提取的根系分泌物能够抑制FON的生长，而未接菌或只接一种菌的番茄的根系分泌物对FON无抑制作用。本研究的结果与之相似，与单作相比，伴生西瓜的根系分泌物均显著地抑制了FON菌落的生长以及孢子的萌发，这说明伴生模式能够改善西瓜病害的发生，可能是因为根系分泌物对病原菌的生长产生抑制作用，从而减缓了病原菌对西瓜的侵害，降低了病害的发生，但还需要进一步验证。分蘖洋葱的根系分泌物可以抑制番茄黄萎病病原菌的生长[31]；抗性棉花品种的根系分泌物可以抑制黄萎病病原菌的菌丝生长和孢子萌发[96]；油菜的根系分泌物中存在的某些物质可以抑制烟草黑胫病病原菌的菌丝的生长[97]，而且根系分泌物某些成分可以感知根际中其它微生物的存在并促进其生长，间接地抑制了病原菌的生长[98]。因此可以推断可能正是由于伴生中这些化感物质的存在，妨碍了病原菌的生长或者是促进了其它菌在根际的定殖，从而缓解了病原菌对西瓜的危害。40 讨论4.3小麦伴生及根系分泌物对西瓜专化型尖孢镰刀菌和假单胞菌菌群丰度的影响西瓜枯萎病是由西瓜专化型尖孢镰刀菌引起的一种真菌病害，可发生在西瓜生长的整个时期。而假单胞菌是一种常见的生防菌，当受到病原菌侵害时，可以帮助植物抵抗病害，促进植物的生长[99-101]。本实验利用Real-timePCR对土壤中的西瓜专化型尖孢镰刀菌和假单胞菌进行了荧光定量的方法来判断它们的菌群丰度。西瓜专化型尖孢镰刀菌的定量采用了巢式PCR，它的定量必须在前一轮PCR产物的基础上进行，因此它的结果不能直接的反应土壤中的西瓜专化型尖孢镰刀菌菌群的真实大小。此方法的缺点是为了保证结果的真确性必须使第一轮PCR未进入平台期[102]。本研究中，伴生西瓜根系分泌物与单作的西瓜根系分泌物对西瓜专化型尖孢镰刀菌和假单胞菌的群落丰度的影响无显著差异，说明伴生作用对它们的群落丰度无影响。而在平板实验中，伴生西瓜根系分泌物能够显著地抑制尖孢镰刀菌的菌丝生长和孢子萌发。可能原因是试验方法的差异可能造成结果的不同，平板试验的环境条件比较单一，根系分泌物的影响作用较大，而土壤条件比较复杂，各种菌群之间也存在的相互作用，根系分泌物的变化对其影响没有那么明显。研究表明[103-105]，枯萎病发病严重的作物土壤中含有较多的尖孢镰刀菌。本研究中伴生有小麦接菌侧显著降低了根际土壤中西瓜专化型尖孢镰刀菌菌群丰度，这与张宁[106]的研究结果相类似，他的结果表明西瓜根际土中尖孢镰刀菌在西瓜与旱作水稻间作中的数量显著低于西瓜单作；伴生无小麦接菌侧与单作接菌侧的菌群丰度无显著差异，这与使用西瓜根系分泌物处理土壤对菌群丰度无影响的结果相一致，说明在伴生体系中小麦能够影响病原菌的丰度，可能是小麦的根系分泌物[107]，它可以降低病原菌的菌群丰度，对病原菌产生抑制作用。本研究中，伴生对假单胞菌菌群丰度的无影响，这与前人的研究结果不一致[108-109]，间套作系统中会导致土壤中假单胞菌的数量上升或下降的趋势，原因可能是试验状态不同，本实验采用的是大田土接种病原菌的方法，在此条件下伴生所引起的土壤环境条件的变化并不足以改变土壤中假单胞菌菌群丰度。4.4小麦伴生对土壤微生物菌群分布和多样性的影响土壤微生物是土壤中不可或缺的一部分，并且在土壤生态过程中发挥着重要的作用，受到多种因素的影响。研究发现，土壤的类型[110]，作物种类[111-112]，耕作方式[113-114]，水肥管理[115-116]，作物的栽培制度[117-118]，外界的环境条件[119,120]等均能改变土壤微生物群落的组成和结构。作物的间套作方式可以显著地影响细菌和真菌群落多样性和丰富度。黄瓜和小麦间作能够提高土壤微生物的多样性，增加它的丰富度和均匀度[121]；在黄瓜连作的休闲期填闲大蒜可以显著地增加土壤微生物的多样性和均匀度[122]；冬季栽培豆角后，采用不同的轮作方式对土壤细菌多样性的影响也不同，其中棉花，小麦，玉米轮作的方式更有利于提高土壤细菌的多样性[123]；与连作相比，大葱轮作显著提高了细菌的多样性和均匀度，但是却降低41 东北农业大学农学硕士学位论文真菌的多样性和均匀度[124]。这与本研究的结果不太一致，本研究的结果表明伴生降低了细菌群落的多样性和均匀度，以及真菌群落的丰富度和多样性，而且在伴生体系中对土壤微生物起作用的主要是小麦，接菌条件未对土壤微生物的多样性产生影响。应用Miseq测序技术研究了小麦伴生后西瓜根际土壤细菌和真菌群落，结果表明，伴生有小麦侧接菌（CWF）与单作接菌（MF）之间的细菌和真菌的群落结构差异较大；而单作各处理（MU和MF）之间，伴生体系各处理（CU，CWF，CF，CWU）相互之间的群落结构差异较小，说明接菌条件对微生物的群落结构的影响较小，而在伴生体系中，主要是小麦的存在影响了土壤微生物的群落结构。各处理中的细菌主要属于变形菌门，拟杆菌门，放线菌门，酸杆菌门，真菌主要属于壶菌门，子囊菌门，接合菌门，担子菌门，这与前人的结果相一致[125-126]。在属水平上，单作（MU和MF）的细菌和真菌群落的结构基本相似，表明西瓜单作中尽管分根两侧的处理方式不同，但单作分根系统中具有相同的微生物类群。在细菌属水平上，与单作接菌侧（MF）和伴生无小麦侧接菌（CF）相比，伴生有小麦侧接菌（CWF）提高了Devosia的相对百分丰度（p=0.017），单作接菌侧（MF）和伴生无小麦侧接菌（CF）的群落相对百分丰度无差异（p>0.05）。与单作未接菌（MU）相比，伴生有小麦侧未接菌（CWU）提高了Devosia，Dyadobacter，Luteimonas，Lysobacter的相对百分丰度（p=0.017，p=0.047，p=0.021，p=0.046），同时降低了norank_o_Subgroup_6，Haliangium，Rhodoplanes，norank_f_RB41（p=0.016，p=0.026，p=0.015，p=0.040）的相对百分丰度；单作未接菌（MU）和伴生无小麦侧未接菌（CU）的群落相对百分丰度无差异（p>0.05）。单作，伴生有无接菌（MU和MF，CU和CF，CWU和CWF）的情况下，它们之间的群落相对百分丰度无差异（p>0.05）。说明接菌条件对微生物群落的无影响，而在伴生体系中，对细菌属水平的起作用的主要是小麦。Devosia是从假单胞菌属中重新分类的，在污染物降解的过程中可以保持植物根际微生物的活性，提高了在生物降解中的修复过程[127-128]。Ohtaekwangia属于拟杆菌门，在降解植物次级有机物中起到重要作用[129]，研究发现它在土壤中的数量与黄瓜枯萎病的发病率呈负相关[130]。Dyadobacter具有降解土壤中有机化合物和碳氢化合物的能力[131]，据报道，它与香蕉的枯萎病害的发病率呈负相关[132]，而且能够抑制莴苣的木栓根病[133]和水稻稻瘟病[134]。研究发现Haliangium可以产生一种新型的抗真菌的代谢物，对于真菌的生长具有广谱的抑制作用[135]。Lysobacte是一类具有溶菌酶基因的菌群[136]，它能够产生一些胞外酶或代谢物质来抑制细菌，真菌，卵菌和线虫的活性[137]，有些能够产生缩氨酸，破坏了其他微生物的细胞壁和薄膜[138]，因此它们对多种病原体具有很强的拮抗作用，是研制一种新的酶和抗菌剂成分重要来源。据报道，Lysobacte在对病原真菌有抑制作用的土壤中含量较高[137]。应用Lysobacte可以降低不同植物病原菌引起的病害的效应已在多种植物上得到了验证，如番茄[139]、甜菜[140]、水稻[141]、大豆[142]、黄瓜[143]等。研究报道Olpidium[144-145]容易侵染植物的根部，造成植物根部褐变，影响植物的生长；Nectriaceae[146-147]包含很多引起植物疾病的种类。本实验中在真菌属水平上，与单作接菌侧（MF）相比，伴生无小麦接菌侧（CF）提高了Olpidium（油壶菌属）的相对百分丰度（p=0.043），伴生体系接菌侧（CF和CWF）均降低了Fusarium（镰孢菌属），Nectriaceae_unclassified（未分类的丛赤壳科）的相对百分丰度（p=0.036，p=0.012）；而伴生分根系统中不同处理间在群落结构相似。说明在伴生体系中，伴生和小麦根系42 讨论分泌物均在真菌属水平起到作用。实验结果表明，无论是在小麦侧还是无小麦侧接菌，伴生均能降低西瓜枯萎病的病情指数，而且两者之间无差异；小麦伴生西瓜后，西瓜的根系分泌物对西瓜专化型尖孢镰刀菌菌群丰度无影响；伴生体系中，小麦对土壤微生物群落结构的变化起到主要作用，而且可以降低尖孢镰刀菌菌群丰度，可能是小麦的根系分泌物影响了土壤微生物群落；可能是小麦的存在改变了西瓜根际的土壤环境，如pH，从而影响了土壤微生物群落结构，因为不同的土壤环境可以改变土壤微生物的群落结构[148-149]；也可能是小麦和西瓜之间存在营养竞争，改变了西瓜根际的养分状况，进而影响了土壤微生物的群落结构[116]。说明伴生对西瓜病情指数的降低，并不是小麦直接作用于病原菌或者伴生引起西瓜根系分泌物的变化而导致的，其病情指数的降低可能是诱导了病程蛋白的表达，及启动了防卫基因的表达[150]，或者是伴生降低了尖孢镰刀菌在西瓜根内的定殖，或者是伴生中变化的微生物作为信号分子提高了植物的抗性[57]。43 东北农业大学农学硕士学位论文5结论1.在水培条件下，小麦伴生西瓜显著降低了西瓜的地上干重（p<0.05），而接种FON后，伴生显著促进了地下部的生长（p<0.05）。土培接菌条件下，小麦伴生显著促进了西瓜的生长（p<0.05）。2.小麦伴生对西瓜枯萎病发病率无影响（p>0.05），但显著的降低了枯萎病病情指数（p<0.05）。3.小麦伴生处理的西瓜根系分泌物显著抑制了FON的生长及其孢子萌发（p<0.05）。4.伴生与单作的西瓜根系分泌物均未对西瓜专化型尖孢镰刀菌和假单胞菌菌群丰度产生显著影响（p>0.05）。伴生、接菌均未显著改变土壤假单胞菌的菌群丰度（p>0.05）；伴生分根体系中，有小麦侧的土壤中西瓜专化型尖孢镰刀菌的菌群丰度在接菌与否的条件下无显著差异（p>0.05）；接菌条件下，与单作相比，伴生显著降低了土壤中FON菌群丰度（p<0.05），与伴生无小麦侧相比，伴生有小麦侧显著降低了土壤中FON菌群丰度（p<0.05）。说明在伴生分根体系中小麦影响了FON菌群丰度。5.与单作相比，伴生有小麦侧改变了细菌的群落组成。伴生无小麦侧和有小麦侧的群落组成相似。接菌条件下，与单作相比，伴生改变了真菌的群落组成和结构、降低了真菌的Shannon指数（p<0.05），伴生有小麦侧降低了真菌的sobs指数（p<0.05）；伴生无小麦侧和有小麦侧的真菌群落结构相似和多样性无显著差异（p<0.05），伴生对细菌群落及其多样性影响不大。说明在接菌条件了，伴生主要影响了真菌的微生物多样性，在伴生分根体系中，有无小麦两侧的微生物群落相似。综上所述，伴生促进了西瓜的生长、降低了西瓜枯萎病的病情指数，接菌条件下，小麦影响了土壤中西瓜专化型尖孢镰刀菌菌群的丰度，伴生改变了真菌群落，对细菌群落影响不大。44 致谢致谢一叶一脉一季节，一枝一芽一秋冬。时间如飞奔的骏马，在我们的身边奔腾而去，而我的三年研究生生活也像耀眼的流星一样，稍纵即逝。回首三年的点点滴滴，无不充斥着感激之情。首先非常感谢我的导师——吴凤芝老师。初接触老师，便被她平易近人的态度所打动，为成为老师的学生而高兴。三年来，在老师的指导下，从对课题的懵懂无知，畏手畏脚，到对课题的了解，积极动手去做，再到对课题的理解，熟练掌握各种实验操作技能，这一过程无不倾注着老师的关心与引导。同时，也非常感谢老师对我任性行为的理解和宽容，使得我拥有了坚持下去的动力。感激之情溢于言表，谢谢您，您辛苦了！其次，非常感谢周新刚老师在实验设计过程给予的帮助，您对科研严肃认真的态度是我们学习的榜样；同时非常感谢潘凯老师和刘守伟老师，李文慧老师在实验用地，实验仪器以及实验中给予的支持，帮助与指导，谢谢您们！再次感谢付学朋，李春霞，高丹美，段亚东，韩哲，陈少灿，于洪杰，沈彦辉，常春玲等师兄师姐们在实验过程中提供的建议与援手，感谢你们共同营造的良好的科研氛围，带领着我们积极快乐的做实验。其中特别感谢李春霞师姐在我实验中遇到困境时给予的无私帮助，在我陷入牛角尖时给予的开导，谢谢！感谢我同届的小伙伴们，李乃荟，李森，姜野，白晶芝，张燕，感谢你们的帮助与支持。感谢李乃荟，李森在你们自身非常劳累的情况下，依然帮我干活；在我不开心时，关心开导我，陪我吃饭，帮我解忧。非常高兴在研究生生涯中遇到你们，跟你们一块学习，一块玩耍。感谢高欢，李红玉，李圆圆等师妹在实验中对我的帮助，正是由于你们善解人意的帮助才使得我的实验能够及时的完成。同时非常感谢刘佳遥，付彦祥师弟，谢谢你们帮我解决了运土的大难题。感谢我的室友们：姜霞，曹宋宋，赵敏对我的宽容与帮助，谢谢你们在这个异乡中给我带来的温暖，让我依然能够感受到浓浓的乡音，谢谢你们的陪伴。特别感恩我的父母，是你们无怨无悔的付出与支持才更加坚定了我的求学道路，你们的无私的关怀和鼓励也是我克服困难的不竭动力，让我一路坚持的走下来，您们辛苦了！感谢哥哥一直以来的支持，在我迷茫彷徨时，给予我鼓励让我坚定信念；在我郁闷纠结时，给予我宽慰让我无后顾之忧。感谢国家基金项目31471917的资助！在此论文完成之际，感激所有关心帮助我的人，谢谢你们！45 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东北农业大学农学硕士学位论文附录a)b)c)56 附录d)注：a代表单作接菌侧（MF），伴生无小麦接菌侧（CF）和伴生有小麦侧接菌共有的细菌菌群；b代表单作接菌侧（MF）独有的细菌菌群；c代表伴生无小麦接菌侧（CF）独有的细菌菌群；d代表伴生有小麦接菌侧（CWF）独有的细菌菌群，下同。Note:ArepresentswatermelonmonocultureandinoculationFON,watermelonwithcompanionwheatandinoculationFON(withoutwheatside)andwatermelonwithcompanionwheatandinoculationFON(withoutwheatside)shareofbacterialcommunity;B,C,DrepresentsuniquebacterialcommunityofwatermelonmonocultureandinoculationFON,watermelonwithcompanionwheatandinoculationFON(withoutwheatside)andwatermelonwithcompanionwheatandinoculationFON(withoutwheatside)shareofbacterialcommunity,respectively.Thesameisasbelow.图A-1接菌侧对土壤细菌属水平共有和独有细菌的影响Fig.A-1EffectofinoculationFONonsoilbacterialprinciplesanduniqueofgenusa)57 东北农业大学农学硕士学位论文b)c)d)图A-2接菌侧对土壤真属水平共有和独有细菌的影响Fig.A-2EffectofinoculationFONonsoilfungalprinciplesanduniqueofgenus58 附录a)b)c)59 东北农业大学农学硕士学位论文d)注：a代表单作未接菌侧（MU），伴生无小麦接菌侧（CU）和伴生有小麦侧接菌共有的细菌菌群(CWU)；b代表单作接菌侧（MU）独有的细菌菌群；c代表伴生无小麦接菌侧（CU）独有的细菌菌群；d代表伴生有小麦接菌侧（CWU）独有的细菌菌群，下同。Note:Arepresentswatermelonmonocultureandnon-inoculationFON,watermelonwithcompanionwheatandnon-inoculationFON(withoutwheatside)andwatermelonwithcompanionwheatandnon-inoculationFON(withoutwheatside)shareofbacterialcommunity;B,C,Drepresentsuniquebacterialcommunityofwatermelonmonocultureandnon-inoculationFON,watermelonwithcompanionwheatandnon-inoculationFON(withoutwheatside)andwatermelonwithcompanionwheatandnon-inoculationFON(withoutwheatside)shareofbacterialcommunity,respectively.Thesameisasbelow.图A-3未接菌侧对土壤细菌属水平共有和独有细菌的影响Fig.A-3Effectofnon-inoculationFONonsoilbacterialprinciplesanduniqueofgenusa)60 附录b)c)d)图A-4未接菌侧对土壤真菌属水平共有和独有细菌的影响Fig.A-4Effectofnon-inoculationFONonsoilfungalprinciplesanduniqueofgenus61 东北农业大学农学硕士学位论文表A-1属水平下相对百分丰度大于0.1%的差异显著的细菌群落Tab.A-1Relativeabundances(>0.1%)ofclassifiedbacterialgenerawithinsignificantdifferentSpeciesnameMFMUCFCWUCUCWFnorank_o_Subgroup8.27±0.67a8.13±0.79a5.85±0.68ab3.91±1.26b6.10±0.37ab6.52±1.22abnorank_f__RB412.96±0.68ab3.47±0.02a2.34±0.27ab1.25±0.24b2.82±0.13ab3.27±1.08aDevosia0.75±0.10bc0.79±0.24bc0.93±0.11bc1.48±0.04a1.04±0.07b1.39±0.13abMicrolunatus1.18±0.06a0.97±0.10ab1.18±0.41a0.52±0.18b0.86±0.15ab0.79±0.08abLuteimonas0.30±0.09ab0.24±0.11b0.36±0.06ab1.29±0.50a0.69±0.45ab0.92±0.32abHaliangium0.71±0.05ab0.73±0.15a0.57±0.16abc0.25±0.09c0.34±0.05bc0.43±0.16abcDyadobacter0.28±0.05b0.28±0.13b0.26±0.04b0.74±0.19a0.32±0.10b0.58±0.18abRhodoplanes0.48±0.04a0.42±0.09ab0.41±0.08ab0.18±0.04c0.27±0.04bc0.32±0.04abcRoseiflexus0.29±0.02a0.23±0.05ab0.28±0.04ab0.15±0.03b0.21±0.06ab0.18±0.03abLysobacter1.79±0.50ab1.61±0.30b2.03±0.55ab3.27±0.82a2.50±0.38ab2.91±0.87ab注：MU西瓜单作未接菌侧；MF西瓜单作接菌侧；CF小麦伴生西瓜无小麦侧接菌；CWU小麦伴生西瓜有小麦侧未接菌；CU小麦伴生西瓜无小麦侧未接菌；CWF小麦伴生西瓜有小麦侧接菌，下同。p<0.05。Note:MUwatermelonofspilt-rootmonocultureandnon-inoculationwithFON;MFwatermelonofspilt-rootmonocultureandinoculatedwithFON;CFwatermelonofspilt-root(oneside)/wheatcompanionandinoculatedwithFON(non-wheatside);CWUwatermelonofspilt-root(oneside)/wheatcompanionandnon-inoculationwithFON(wheatside);CUwatermelonofspilt-root(oneside)/wheatcompanionandnon-inoculationwithFON(non-wheatside);CWFwatermelonofspilt-root(oneside)/wheatcompanionandinoculatedwithFON(wheatside).Thesameisasbelow.p<0.05.62 附录表A-2属水平下相对百分丰度大于0.1%的差异显著的真菌群落Tab.A-2Relativeabundances(>0.1%)ofclassifiedfungalgenerawithinsignificantdifferentSpeciesnameMFMUCFCWUCUCWFFusarium27.93±12.10a5.49±2.28b8.39±3.65b3.27±1.08b5.90±3.52b3.66±0.27bNectriaceae_unclassified0.43±0.25a0.20±0.06ab0.08±0.01b0.03±0.00b0.08±0.0.06b0.09±0.06bOlpidium26.64±13.43b52.40±21.70ab78.24±2.18a56.67±13.38ab63.40±26.93ab71.54±14.55ab（注：p<0.05）63 东北农业大学农学硕士学位论文攻读硕士学位期间发表的学术论文张晓晓，安美君，吴凤芝.不同生态条件对西瓜根际土壤微生物群落结构的影响[J].北方园艺，2017(03)：101-108.64