DB65∕T 4203-2019 绵羊胚胎玻璃化冷冻保存技术操作规程(新疆维吾尔自治区)

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1、ICS65.020.30B43DB65新疆维吾尔自治区地方标准DB65/T4203一-2019绵羊胚胎玻璃化冷冻保存技术操作规程Technicalregulationsforvitrificationofsheepembryos2019-07-01发布2019一08-01实施新疆维吾尔自治区市场监督管理局发布D865/T4203--2019目IJ吕本标准按照GB/T1.1一2009((标准化工作导则第l部分:标准的结构和编写》的要求编写。本标准由新疆维吾尔自治区畜牧兽医局提出。本标准由新疆维吾尔自治区畜牧兽医

2、局归口并组织实施。本标准由新疆维吾尔自治区标准化技术委员会技术归口。本标准主要起草单位:新疆畜牧科学院生物技术研究所(新疆畜牧科学院中国一澳大利亚绵羊育种研究中心)、新疆维吾尔自治区畜牧总站、新疆华牛夭俊种畜繁育工程有限公司。本标准主要起草人:汪立芹、耿娟、林嘉鹏、陈莹、吴阳升、李晓林、韩冰、黎霞、秦荣艳、唐森、阿米娜·阿布都瓦力、程黎明、张建光、卢全康、黄俊成。本标准实施应用中的疑问，请咨询新疆畜牧科学院生物技术研究所(新疆畜牧科学院中国一澳大利亚绵羊育种研究中心)/新疆维吾尔自治区畜牧总站。对本标准的修改

3、意见建议，请反馈至新疆维吾尔自治区市场监督管理局(乌鲁木齐市新华南路167号)、新疆维吾尔自治区畜牧兽医局(乌鲁木齐市新华南路408号)、新疆畜牧科学院生物技术研究所(乌鲁木齐市经济技术开发区阿里山街468号〉、新疆维吾尔自治区畜牧总站(乌鲁木齐市新华南路408号〉。新疆维吾尔自治区市场监督管理局联系电话:0991-2817197;传真:0991-2311250;邮编:830004新疆维吾尔自治区畜牧兽医局联系电话0991-8567332;传真0991-8567332;邮编830004新疆畜牧科学院生物技术研

4、究所联系电话0991-3075298;传真0991-3075270;邮编830000新疆维吾尔自治区畜牧总站联系电话0991-8560180;传真0991-8560180;邮编830004I0865/T4203--2019绵羊胚胎玻璃化冷冻保存技术操作规程1范围本标准规定了绵羊胚胎来源、玻璃化冷冻解冻操作所需液体的配制、胚胎玻璃化冷冻和胚胎解冻等技术操作规程。本标准适用于绵羊体内或体外胚胎玻璃化冷冻解冻技术操作。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于

5、本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本〈包括所有的修改单〉适用于本文件。GB/T5458液氮生物容器NY/T1571羊胚胎移植技术规程DB65/T4073成年绵羊体外胚胎生产技术操作规程DB65/T4120绵羊冷冻胚胎3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1玻璃化冷冻vitrification将需要保存的细胞样品，依次置于浓度梯度升高的冷冻保护剂中，置换出细胞胞质内的水分，引起内源性胞质大分子如蛋白质及渗透到胞内的冷冻保护剂浓缩，通过将载有细胞的高浓度冷冻保护剂，在超低温环境下凝固，形成不规则的玻璃

6、化样固体，保存了液态时正常分子和离子分布，因而使细胞在剧烈的快速降温中不会因胞质内的水分凝结为冰晶而破坏质膜，从而起到保护作用的方法。4绵羊幼羔供体的选择4.1体内胚胎按照NY/T1571的规定，选择遗传性能稳定、系谱清楚、体质健壮、繁殖机能正常的优良品种供体用来生产胚胎。应用超数排卵、人工输精、手术冲胚的方法采集处于囊胚期至孵化期发育阶段的胚胎，用玻璃化冷冻方法进行冷冻保存。4.2体外胚胎按照DB65/T4073的规定，通过腹腔镜、手术等方式对绵羊卵巢进行活体采卵，或者摘取屠宰后的绵羊卵巢进行离体采卵，将回

7、收到的卵母细胞进行体外成熟、体外受精、体外培养，得到处于囊胚期至孵化期发育阶段的体外胚胎，用玻璃化冷冻方法进行冷冻保存。DB65/T4203--20195玻璃化冷冻保存液和解冻液的配制5.1所需试剂见表10表1玻璃化冷冻保存过程中所需试剂名称规格货号Mediurn199(M199)500rnL12340-030胎牛血清(FBS)500rnL16000-044乙二醇(EG)500rnLE9129二甲基亚WX(DMSO)500mLD4540庶糖500gS18885.2冷冻液、解冻液配方5.2.1玻璃化冷冻操作过

8、程中使用的工作液分别是HM、VSLVS2，配方如下:a)HM:90%M199+10%FBS;b)VS1:80%HM+I0%EG+10%DMSO;c)VS2:50%刚十20%EG+20%DMSO+10%0.5mol/L庶糖。5.2.2玻璃化冷冻胚胎解冻操作过程中使用的工作液分别是阳、O.5rnol/L庶糖、0.25mol/L庶糖，配方如下:a)Th~:90%M199+10%FBS;b)0.5rnol/