根霉源酸性蛋白酶的初步研究

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1、根霉源酸性蛋白酶的初步研究酸性蛋白酶可在酸性条件下降解蛋白质，由于酸性蛋白酶具有较好的耐酸性，因此，被广泛用于食品、医疗工业及畜牧业生产中。目前，酸性蛋白酶主要通过微生物发酵来生产的。而工业上，酸性蛋白酶的生产菌只有黑曲霉、宇佐美曲霉和米曲霉等为数不多的菌株，通过筛选新的菌种，可以有效地解决目前行业中存在的酶活低及菌种老化的问题。本研究通过酪蛋白透明圈法从实验室保存的几株菌株中筛选出一株产酸性蛋白酶菌株，命名为RN-11菌株，通过真菌ITS序列分子鉴定，再结合对其形态观鉴定的结果，将RN-11菌株确定为黑根霉(匍枝根霉)。采用固态发酵培养法，通过单因素实验及响应面实验设计，确定了RN-

2、11菌株产酸性蛋白酶最佳固态培养基组分为：250ml三角瓶中，萩皮15g,水10.6ml,蔗糖0.69g，硝酸钠1.0g，磷酸氢二钾0.042g。理论最佳酸性蛋白酶活力为159.51U/g，验证试验得到的实际平均酸性蛋白酶活力为160.16U/g，比初始发酵培养基提高了5.1倍。该菌株在最佳培养基初始pH值为2.5,装瓶量为27g湿基，接种量为1ml,培养时间为60h，培养温度26℃时，产酶量达到最高。分别选择蒸馏水、0.05mol/L(pH3.5)的乳酸缓冲液、0.15mol/L的NaCl溶液、0.03mol/L磷酸缓冲液作为提取溶剂提取酸性蛋白酶。结果表明：用0.05mol/L乳酸

3、缓冲液浸提，酸性蛋白酶提取最完全。还对影响酶提取的主要因素，如提取溶剂pH、提取时间、提取温度、浸提液和固体培养基的比率进行了研究，确立了最适的酶提取工艺。结果表明RN-11酸性蛋白酶在用固体曲重量30倍的0.05mol/L的pH3.0孚L酸缓冲液于30c水浴中浸泡105min提取最完全。通过硫酸钱分级沉淀、透析、SephadexG-75凝胶层析三步提取纯化了RN-11酸性蛋白酶。酶的回U攵率为24.39%,纯化彳数为41.78。酶学性质测定结果表明，经SDS-PAG电泳，RN-11酸性蛋白酶的分子量约为70Kda该酸性蛋白酶最适pH范围为2.0³.0,最适反应p

4、H为2.5,在pH值2.0⁴.0之间酶活相对比较稳定；适宜温度为40⁵0C,其最适反应温度为50C,在30⁵0℃之间有较好的热稳定性；发现终浓度为5Mmol/LNa+、K+、Mn²⁺Cu²⁺Ca²⁺²⁺hf可使酶活提高1.4倍，而Zn²⁺、Li²⁺、Fe²⁺对酶活有不同程度的抑制作用，加入Mg²⁺t酶活性基本没影响

5、。