法医学硕士论文-ryrs在兔阴茎海绵体平滑肌细胞的表达及作用

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1、旦欠攀。学校代码10246学号032101053硕士学位论文院系(所)专业姓名上海医学院法医学刘洪国指导教师：叁￡：垄—!堕丝完成日期：!垒!!生!旦●中文摘要目的研究兔阴茎海绵体平滑肌(CCSM)细胞的体外培养方法，兰尼碱受体(RyRs)在CCSM细胞中的表达情况及在胞内[Ca”]。浓度调节中的作用。方法取雄性性成熟新西兰兔，取出阴茎海绵体，用组织块法进行细胞培养，差速贴壁法细胞纯化，利用倒置显微镜观察、免疫荧光染色法鉴定细胞纯度；取3代以内CCSM细胞，通过Genebank查出RyRscDNA序列，针

2、对RyRs3种不同亚型的非同源部分用PrimerPremier5．0软件设计3对引物，以逆转录PCR(RT-PcR)方法分别检测RyRs3种亚型mRNA的表达，凝胶成像系统分析结果；取生长旺盛的CCSM细胞，分为A、B两组，以Fluo．3，AM荧光染色，A组：10llmol／L去甲肾上腺素(NE)激发，B组：50llmol／L普鲁卡因+10umol／LNE激发，以激光扫描共聚焦显微镜观察胞内[Ca2+]。浓度变化。结果培养7d开始有细胞从组织块长出，15—20d后长满瓶底，呈典型的“峰一谷”现象，经倒置显

3、微镜观察，见培养的细胞呈现典型的梭形，免疫荧光染色可见细胞内染为绿色的肌丝，证实培养的细胞为CCSM细胞，经差速贴壁法纯化后，细胞纯度接近100％。经RT．PCR检测，CCSM只表达RyRsl，未见RyRs其余亚型的表达；共聚焦显微镜下见细胞胞浆内绿色荧光着色，胞核不着色，A组加入NE激发后，胞内[ca2+]。浓度迅速升高，持续一段时间后下降，升高均值为44．10±6．01％。预先用普鲁卡因处理的细胞，加NE激发后，[Ca2+]。浓度上升的幅度及持续时间均减少，升高均值为32．92±4．92％，两组对比有

4、明显差异。结论CCSM经组织块法培养及纯化后，可以达到很高的纯度，能为其他实验提供纯的CCSM细胞材料；CCSM细胞表达RyRsl亚型；RyRsl参与CCSM细胞的[Ca2+]。调节，虽然可能不是主要作用，但提示我们多角度地开展研究可以更全面地掌握阴茎勃起及ED的本质。关键词：细胞培养兰尼碱受体游离钙阴茎海绵体中图分类号：R89簟●AbstractobjectiveToinvestigatemethodsofrabbitpenilecorpuscavemosumsmoothmuscle(CCSM)cell

5、culture．TostudyexpressionandfunctionofRyanodinereceptors(Rye)．MethodsNewZealandWhiteRabbitCCSMcellswereculturedbyprimarytissueculture．ForCCSMcellsandfibroblastshavedifferentadherencevelocity,CCSMcellscanbepurified．IdentificationofCCSMcellswasbyinvertedmic

6、roscopeandimmunofluoreseencetechnique．TheeDNAsequenceofRyRswasfoundoutbysearchingGenebank．Threepairsofprimersweredesignedthrou曲PrimerPremier5．0software．ThemRNAofRyRssubunitswasdetectedbyreversetranscri【ptionPCR(RT-PCRlinculturedCCSMcells．VigorousCCSMcells

7、weredividedintogroupAandB．GroupA：CCSMcells+10lamol／Lnoradrenaline．GroupB：CCSMcells+50lamol／Lprocaine+10pmol／Lnoradrenaline．【Caz+】iwasdyeingbyFluo一3／AM．Concentrationof【Ca2+]linCCSMcellswasdetectedbylaserscanningconfocalmicroscopy(LSCM)．ResultsAfter7days．we

8、foundgrowthofculturedcells．W1lile15—20days，CCSMcellsfilledthebottomofcultureflask．Theywereidentifiedbyinvertedmicroscopeandimmunofluorescencetechnique．Afterpurification,purityofCCSMcellsWasnearto100％．Itsuggestedonly