DB15∕T 2593—2022 冰草组织培养技术规程(内蒙古自治区)

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ICS65.020.20CCSB2115内蒙古自治区地方标准DB15/T2593—2022冰草组织培养技术规程Technicalcodeofpracticefortissuecultureofagropyroncristatum2022-06-24发布2022-07-24实施内蒙古自治区市场监督管理局发布

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2DB15/T2593—2022前言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由内蒙古自治区林业和草原局提出并归口。本文件起草单位：中国农业科学院草原研究所、内蒙古农业大学。本文件主要起草人：徐春波、王勇、赵海霞。I

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4DB15/T2593—2022冰草组织培养技术规程1范围本文件规定了冰草组织培养的术语与定义、培养基、外植体、愈伤组织诱导培养、增殖培养、分化培养、生根培养、炼苗与移栽等基本内容及技术要求。本文件适用于冰草组织培养育苗。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T603化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备NY/T2306-2013花卉种苗组培快繁技术规程DB15/T1940-2020西部沙樱组织培养技术规程3术语和定义NY/T2306界定的术语和定义适用于本文件。冰草agropyroncristatum(L.)gaertn属于禾本科（Gramineae）冰草属（Agropyron）多年生草本植物。幼穗youngear生长2至5年、长度1cm～3cm的冰草孕穗。种子seed有生活力、饱满的包含内外稃的冰草种子。成熟胚matureembryo完熟期冰草种子的胚。4环境与器具灭菌1

5DB15/T2593—2022参照DB15/T1940执行。5培养基基本培养基MS培养基、1/2MS、改良MS培养基见附录A。母液的配制和保存5.2.1配制将常用试剂配制成50～100倍的母液，按照GB/T603规定方法配制。所用激素均配制浓度为0.5mg/mL，配制方法详见附录B。5.2.2保存母液配制好分别贴上标签，注明溶液名称、配制倍数、配制日期、配制者。母液贮存在4℃的冰箱中。贮藏时间在3个月之内，有霉菌和沉淀产生，则不得使用。培养基的配制5.3.1配制配置1L培养基时，先加蒸馏水600ml～700ml，再加入7.5g琼脂，加热搅拌琼脂融化后加入25g蔗糖，搅拌溶解后再分别加入母液，搅拌均匀，加蒸馏水定容至1L。5.3.2pH值调节用1mol/L的NaOH将配制好的培养基调到pH值5.8～6.0，用酸度计或精密pH试纸测定。5.3.3分装和灭菌配制好的培养基趁热分装。分装量以占培养容器的1/4～1/3为宜。切勿将培养基沾到瓶口和外壁上，以免招致杂菌污染。分装后立即加盖，不同的处理做好标记。分装后进行灭菌，121℃状态下保持20min。6外植体外植体选择幼穗或成熟胚。外植体制备6.2.1幼穗在超净台上用75%酒精脱脂棉球擦洗叶鞘表面消毒，剥出幼穗，切成0.3cm～0.5cm的小段。6.2.2成熟胚2

6DB15/T2593—2022种子用水浸泡2h～4h后，剥去内外稃，置于湿滤纸上吸胀4h。在超净工作台上75%酒精消毒30s，无菌水冲洗至少3次后用0.2%升汞消毒5min，再用无菌水冲洗数次至少3次。置于铺有湿无菌滤纸的培养皿中，用解剖针从盾片处挑出胚。7愈伤组织诱导培养幼穗7.1.1培养基幼穗愈伤组织诱导培养基为改良MS+2.0mg/L2，4-D。7.1.2接种22将幼穗段接种在愈伤组织诱导培养基上，每2.5cm～3cm接种1个，均匀摆放，封好皿口，标明名称和日期。7.1.3培养条件24℃～26℃暗培养。7.1.4培养时间培养20d～30d。成熟胚7.2.1培养基成熟胚愈伤组织诱导培养基为MS＋0.2mol/L甘露醇+2.0mg/L2，4-D。7.2.2接种22将成熟胚接种在愈伤组织诱导培养基上，每1.5cm～2cm接种1个，均匀摆放，封好皿口，标明名称和日期。7.2.3培养条件见本文件7.1.3。7.2.4培养时间培养14d～20d。8增殖培养幼穗8.1.1培养基幼穗增殖培养基为改良MS+2.0mg/L2，4-D+0.2mg/L6BA。8.1.2接种3

7DB15/T2593—202222在超净工作台上，将诱导出的愈伤组织转到增殖培养基上，每4cm～5cm接种1个，均匀摆放，封好皿口，标明名称和日期。8.1.3培养条件见7.1.3。8.1.4培养时间培养40d～50d；每20d换1次培养基。成熟胚8.2.1培养基成熟胚增殖培养基为MS＋0.2mol/L甘露醇+2.0mg/L2，4-D+0.3mg/LABA。8.2.2接种22在超净工作台上，将诱导出的愈伤组织转到增殖培养基上，每3cm～4cm接种1个，均匀摆放，封好皿口，标明名称和日期。8.2.3培养条件见7.1.3。8.2.4培养时间培养40d～60d；每20d换1次培养基。9分化培养幼穗9.1.1培养基幼穗分化培养基为MS+3.0mg/LKT+0.5mg/LNAA。9.1.2接种22在超净工作台上，挑选状态较好的胚性愈伤组织转入分化培养基，每5cm～6cm接种1个，均匀摆放，封好瓶口，标明名称和日期。9.1.3培养条件24℃～26℃，全天光照培养，光照强度3000Lux～4000Lux。9.1.4培养时间培养40d～60d；每20d换1次培养基。成熟胚9.2.1培养基4

8DB15/T2593—2022成熟胚分化培养基为MS＋3.0mg/LKT＋1.0mg/LNAA。9.2.2接种22在超净工作台上，挑选状态较好的胚性愈伤组织转入分化培养基，每5cm～6cm接种1个，均匀摆放，封好瓶口，标明名称和日期。9.2.3培养条件24℃～26℃，每天光照时间16h，光照强度3000Lux～4000Lux。9.2.4培养时间培养60d～90d；每20d换1次培养基。10生根培养幼穗10.1.1培养基幼穗生根培养基为改良1/2MS+0.1mg/LNAA。10.1.2接种在超净工作台上，将长至3cm～4cm的小苗逐一转入生根培养基，每器皿接种1苗，封好瓶口，标明名称和日期。10.1.3培养条件见9.1.3。10.1.4培养时间培养20d～30d。成熟胚10.2.1培养基成熟胚生根培养基为1/2MS＋0.5mg/LNAA。10.2.2接种在超净工作台上，将长至3cm～4cm的小苗逐一转入生根培养基中，每器皿接种1苗，封好瓶口，标明名称和日期。10.2.3培养条件见9.2.3。10.2.4培养时间培养20d～30d。5

9DB15/T2593—202211炼苗与移栽炼苗选择生长健壮的组培苗，打开封口膜，放在自然光、室温下2d～3d。基质营养土与蛭石1:1混合。经高压灭菌后装入花盆备用。移栽取出组培苗，洗掉培养基，栽入花盆，浇水，放入温室，套上带孔的塑料袋保湿，一周后取掉，适当保温，常规管理。待苗长至20cm～30cm移栽至大田。6

10DB15/T2593—2022AA附录A（规范性）基本培养基成分基本培养基成分见表A.1。表A.1基本培养基成分类型组分MS培养基改良MS培养基KNO31900.01900.0NH4NO31650.0956.0大量元素MgSO4·7H2O370.0370.0KH2PO4170.01160.0CaCl2·2H2O440.096.0MnSO4·4H2O22.3022.30ZnSO4·7H2O8.6008.600H3BO36.2006.200微量元素KI0.8300.830Na2MoO4·6H2O0.2500.250CuSO4.5H2O40.0250.025CoCl2.6H2O0.0250.025Na2-EDTA37.3037.30铁盐FeSO4.7H2O27.8027.80甘氨酸2.0002.000盐酸吡哆辛0.5000.500盐酸硫铵素0.1002.000有机物烟酸0.5001.000肌醇100.0100.0尼克酸--------7

11DB15/T2593—2022BB附录B（规范性）激素的配制激素配置方法见表B.1。表B.1激素配置方法类别名称配制方法灭菌方式存储方式2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）用适量无水乙醇溶解后加入去离冷藏（4℃），生长素高温灭菌子水定容。密封，避光保存萘乙酸（NAA）6-苄基嘌呤（6-BA）用适量0.1M的盐酸（HCL）溶解冷藏（4℃），细胞分裂素高温灭菌后加入去离子水定容。密封，避光保存激动素（KT）用适量无水乙醇溶解后加入去离脱落酸脱落酸（ABA）过滤灭菌现配现用子水定容。8