两种活性羰基类物质对ecv304细胞的毒性研究

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1、动物医学进展，２０１４，３５（１２）：６９－７２ＰｒｏｇｒｅｓｓｉｎＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ两种活性羰基类物质对ＥＣＶ３０４细胞的毒性研究张天宇，李盼盼，穆颖颖，武召珍，杨鸣琦＊，董强＊（西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌７１２１００）摘要：为探讨乙二醛（ＧＯ）和甲基乙二醛（ＭＧＯ）对上皮细胞的细胞毒性及其机制，分别以ＭＴＴ法检测两种活性羰基化合物（ＲＣＳ）对ＥＣＶ３０４细胞活力的影响，评价其细胞毒性；ＤＣＦＨ－ＤＡ探针法检测氧化应激；用罗丹明１２３检测线粒体膜电位及线粒体形态变化。结果表

2、明，ＧＯ和ＭＧＯ对ＥＣＶ３０４细胞的ＩＣ５０分别为３．６ｍｍｏｌ／Ｌ±０．１ｍｍｏｌ／Ｌ和１．３ｍｍｏｌ／Ｌ±０．１ｍｍｏｌ／Ｌ；氧化应激水平小幅度增高，线粒体膜电位随发生改变；线粒体形态发生改变。ＧＯ和ＭＧＯ的细胞毒性与氧化应激水平增加相关性较低而与线粒体损伤相关。关键词：活性羰基化合物；细胞毒性；线粒体膜电位；氧化应激中图分类号：Ｓ８５２．２；Ｓ８５７．２１文献标识码：Ａ文章编号：１００７－５０３８（２０１４）１２－００６９－０４奶牛亚临床子宫内膜炎和胚胎死亡在临床上发Ａｍｒｅｓｃｏ公司；ＤＭＥＭ培

3、养基购自Ｇｉｂｃｏ公司；胎［１］病率较高，分别为４２％和５０％，主要原因为急性牛血清购自Ｈｙｃｌｏｎ公司；ＭＧＯ、ＧＯ、氨基胍、罗丹［２］或持久性的慢性炎症导致子宫感染。晚期蛋白质明１２３、ＤＣＦＨ－ＤＡ等购自Ｓｉｇｍａ公司；其他常用试氧化产物（ａｄｖａｎｃｅｄｏｘｉｄａｔｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｐｒｏｄｕｃｔｓ，剂购自国药集团化学试剂有限公司。ＡＯＰＰ）和糖基化晚期终末产物（ａｄｖａｎｃｅｄｇｌｙｃａｔｉｏｎ１．１．２主要仪器ＥＶＯＳｆ１型数码倒置显微镜，ｅｎｄｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＡＧＥｓ）分别促进了急性和

4、慢性炎症ＶＩＣＴＯＲＴＭＸ５型全波长荧光酶标仪，Ｅｐｏｃｈ型微［３］的发生。当机体发生氧化应激及羰基应激时，蛋孔板分光光度计，漩涡混合器。白质氧化损伤增强，ＡＯＰＰ和ＡＧＥｓ生成增加激活１．２方法其受体，导致活性氧（ｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓ，ＲＯＳ）１．２．１细胞培养ＥＣＶ３０４细胞（一种永生化的人［４］水平上升，诱发子宫内膜炎。ＡＧＥｓ是由活性羰源内皮细胞），购自武汉大学细胞保藏中心。以每孔基化合物（ｒｅａｃｔｉｖｅｃａｒｂｏｎｙｌｓｐｅｃｉｅｓ，ＲＣＳ）攻击氨基１０４个细胞接种于９

5、６孔板，以含１００ｍＬ／Ｌ胎牛血酸、多肽或蛋白质，经Ｓｃｈｉｆｆｂａｓｅ和Ａｍａｄｏｒｉ等一清的ＤＭＥＭ培养基培养。培养于３７℃、体积分数系列复杂的化学重排反应后形成的不可逆的交联产为５％ＣＯ２细胞培养箱内。［５］物。甲基乙二醛（ｍｅｔｈｙｌｇｌｙｏｘａｌ，ＭＧＯ）和乙二醛１．２．２ＭＴＴ法检测细胞活力活细胞可通过线粒（ｇｌｙｏｘａｌ，ＧＯ）是体内毒性较大的ＲＣＳ。ＭＧＯ和体能量代谢过程中的琥珀酸脱氢酶将ＭＴＴ还原形ＧＯ来源于糖酵解的中间产物磷酸丙糖和糖异生中成蓝紫色甲臜沉积于细胞内，通过对甲臜产物的比

6、酮体的分解，反刍动物瘤胃内的微生物菌群在高糖色分析来可用于测定细胞的活力。接种于９６孔板［６］环境下也会大量合成ＭＧＯ。在形成ＡＧＥｓ的过的细胞达到平台期后，与不同浓度ＧＯ或ＭＧＯ（溶程中，活性羰基化合物不但造成羰基应激，而且引起于含１００ｍＬ／Ｌ胎牛血清的ＤＭＥＭ培养基）孵育２４氧化应激，导致上皮细胞代谢障碍和细胞功能障ｈ后，弃上清，加入２００μＬ含ＭＴＴ（０．５ｍｇ／ｍＬ）的［７］碍。本文以内皮样ＥＣＶ３０４细胞为研究对象，初培养基。在３７℃孵育４ｈ后，弃上清，形成的晶体用步研究ＭＧＯ和ＧＯ对内皮细

7、胞的毒性及机制，为２００μＬ二甲亚砜溶解２０ｍｉｎ，振荡混匀。在４９０ｎｍ探讨ＡＧＥｓ与子宫内膜炎症的关系提供依据。［８］处用Ｅｐｏｃｈ型微孔板分光光度计读取吸光度值。１材料与方法细胞活力百分率＝（试样组ＯＤ值／阴性对照组ＯＤ１．１材料值）×１００％，半致死浓度（ＩＣ５０）以Ｒｅｅｄ－Ｍｕｅｎｃｈ法１．１．１主要试剂四甲基偶氮唑盐（ＭＴＴ）购自得出。收稿日期：２０１４－０５－１４基金项目：国家自然科学基金项目（３１００１０９０）；陕西省博士后基金项目作者简介：张天宇（１９８９－），男，内蒙古赤峰人，硕士

8、研究生，主要从事氧化损伤和生化分子毒理学研究。＊通讯作者７０动物医学进展２０１４年第３５卷第１２期（总第２５８期）１．２．３ＤＣＦＨ－ＤＡ法测定细胞内ＲＯＳ细胞内生成的ＲＯＳ用非特异性ＲＯＳ探针（ＤＣＦＨ－ＤＡ）检［８］测。以不同浓度ＧＯ或ＭＧＯ孵育，对２ｍｍｏｌ／Ｌ和４ｍｍｏｌ／Ｌ另设置同浓度氨基胍干预组孵育细胞，３７℃、体积分数为５％ＣＯ２条件下孵育３ｈ。弃上清，毎孔加入１５０μＬ含１０μｍｏｌ／ＬＤＣＦＨ－ＤＡ的培养基，孵育２０ｍｉｎ