抗原基因密码子及其表达载体的优化增强h5亚型禽流感dna疫苗的免疫保护效果博士论文

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1、中国农业科学研究院博士学位论文抗原基因密码子及其表达载体的优化增强H5亚型禽流感DNA疫苗的免疫保护效果姓名：姜永萍申请学位级别：博士专业：预防兽医学指导教师：于康震;陈化兰20040601中国农业科学豌博士学位论文摘要摘要禽高致病力禽流感(tiP／d)被国际兽医局列为A类烈性传染痛。近年来发现，H5和H7噩型高致病力禽流感病毒(HPAIV)棚给养禽业造成巨大损失，而且可以感染人并致人死亡，HPAI作为一种新的入畜共患病，具有重要的公共卫生学意义，5i'ijI-IPAI的防制是关系养禽业健康发展与人类生命安全的重大课题。DNA疫苗是防制禽流感最具潜力的基因工程疫

2、苗之一。以HPAIVA／Ooose／GuangDong／1／96(HSNl)【GDIIl96(HSNI)】野生型HA基因为免疫原基因、以台'CMV启动子一增强子的pcI为载体构建的pCIHA为H5亚型DNA疫苗，分别以100pg、5099和10ug剂量免疫SPF鸡，进行免疫后攻毒保护试验及保护性抗体持续期研究。试验结果表明，pCIHA以100p．g、50"．g两次免疫可诱导高水平的Hl抗体，对HPAIVGDftt96(HSNl)攻击形成100％的完全免疫保护(不发病、不排毒)，免疫后诱导的有效保护性HI抗体可以持续一年以上：10p．g免疫则未能形成对高致病力禽流

3、感病毒攻击的完全保护。与传统的全病毒灭活疫苗相比，DNA疫苗防制H5亚型高致病力禽流感具有免疫保护期长、不干扰常规血清学免疫监测的突出优点，但也存在免疫剂量大、使用成本高的缺陷。免疫原基因的密码子及其真核表达载体的优化是提高DNA疫苗免疫保护效果的有效策略。编码氨基酸密码子的摇摆性导致了不同物种间细胞在蛋白翻译过程中具有密码子使用的偏嗜性。鸡与哺乳动物细胞在蛋白翻译过程中具有相同的密码子偏嗜性，但与A型流感病毒保护性免疫原HA蛋白氨基酸密码子使用频率存在着明显差异。为此，利用寡核苷酸合成及重叠延伸PCR法构建了密码子优化的GD／I／96CH5Nj)的HA基因(o

4、ptiHA)．作为H5亚型禽流感阶执疫苗免疫原基因，以及野生型HA基因，分别插入CMv启动子表达载体pCI和鸡B-acdn启动子表达载体pCAOOS，构建的H5亚型DNA疫苗质粒pCIHA、pcIopIiHA、pCAGGHA和pCAGGopIiHA分别转染293T细胞，Western-blor旺实H5亚型HA抗原蛋白在上述4种表达质粒均可获得正确表达：间接免疫荧光检测转染后24--48tJq{寸'293T细胞中瞬时表达的HA抗原蛋白，密码子优化的HA基因表达水平显著高于野生型HA基因。这一结果为进一步开展SPF鸡免疫保护效果的比较研究、遵选优化的H5亚型DNA疫

5、苗及达到增强免疫效果同时降低有效免疫剂量的目的奠定了基础。为评估HA基因密码子优化及不同表达载体对H5亚型禽流感DNA疫苗免疫效果的影晦，pCII-IA、pCAOGHA、pCloptiHA和pCAGOoptiHA分别以t00ttg和10J．tg剂量一次免疫3周龄SPF鸡，4周后分别用100LD∞的}丑强IvA圮hi呔％aN，4S，ol(HSNi)fLN／45／01(I-15N1)】鼻腔途径进行攻击，观察发病与死亡情况，分别于攻毒后第3、5、7采集喉头及泄殖腔拭子进行病毒分离、滴定检测排毒情况，同时检测免疫后、攻毒前及攻毒后血清HI抗体、AGP抗体的动态变化，对四

6、种疫苗单次免疫的免疫保护效果进行比较评估。结果，100烬剡量组中，pCAOOoptiHA和pCAGGI-[A均可对免疫鸡形成100％完全保护(不发病、不致死、不捧毒)，pCIopliHA和pCmA仅胃形成部分免疫保护；四釉DNA疫苗单次免疫所诱导的平均m抗体水平由高到低依次为pCAGGoptiHA、中国农业科学院博士学位论文摘要pCAC,GHA、pCloptiHA和pCmA。10lAg剂量免疫组中，pcAGGoptiHA和pCAGGHA可对免疫鸡形成100％完全保护(不发病、不致死、不排毒)，pcloptil-lA可形成对免疫鸡的部分免疫保护，面pCIHA则基本

7、不能形成免疫保护；四种DNA疫苗10)_ig单次免疫所诱导的平均HI抗体水平以pCAGGoptiHA最高，pCAGGHA和pcloptiHA其次，pCIHA最差。为进一步评估二次免疫条件下HA基因密码子优化及不同表达载体对H5亚型DNA疫苗免疫效果的影响，质粒pCAGOHA、pclopfiHA和pCAGGoptiHA分剔以]00pg和tong肌肉注射免疫3周龄SPF鸡，免疫后第4周以同样剂量和途径加强免疫，加强免疫2周以100LD50的HPAIVLN／45101(H5N1)鼻腔感染攻毒，对三种疫苗加强免疫后的免疫保护效果进行比较评估。结果，100pg剂量加强免疫

8、组中，pCAOC,opt