ndv和apmv-4的f和hn蛋白糖基化位点的差异分析比较

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1、NDV和APMV-4的F和HN蛋白糖基化位点的差异分析比较袁小远杨金兴张玉霞孟凯奎葱王友令艾武山东省农业科学院家禽研究所本文就禽副黏病毒的两种不同血淸型APMV-1（以NDV为代表）和APMV-4的F和HN蛋白糖基化位点进行分析比较。分析显示:F蛋白糖基化位点NDV强弱毒株毒株均有6处糖基化位点，而APMV-4毒株则只有4处潸在的糖基化位点，而且位置与APMV-1略有不同。同时，NDV强毒株GM的HN蛋白有5个潜在的糖基化位点，而LaSota弱毒株有6个潜在的糖基化位点，即538540位为NKT;APMV-4毒株有7处潜在的糖基化位点，且位置与APMV-1完全不一致。关键词：新城疫病

2、毒;禽副黏病毐;F/HN蛋白；糖基化位点;袁小远（1980.01-）,女，汉，山东荣成人，，研究方向：禽病分子生物学与免疫学。E-mail:xyyuanl980@163.com。王友令（1974-）,男，副研允员，研允方向：家禽疫病防控研宄。E-mail:wangyouling71@163.com。艾武（1964-）,女，研究员，研究方向：家禽疫病诊断与防治。E-mail:767068849@qq.com.cno2017-11-17基金：山东省农业科学院青年棊金项A（2014QNM15）:山东省农业科学院科技创新工程项目（CXGC2016A10）Received：2017-11-17

3、禽副黏病毒病（AvainParamyxoviridaevirus,APMV）是当今危害全球养禽业的重要疫病之一，其病原共有九个血清型（APMV广9）U1。禽副粘病毒1型最常见的是新城疫病毒（NDV），ND是引起家禽等的一种急性、烈性传染性疾病，发病率和死亡率均很高，并且多种禽类等都可以感染。NDV是禽副黏病毒1型的代表，也是各型禽副黏病毒型中研宄最为透彻的，而对禽副黏病毒APMV2~9的分子特性和致病性知之甚少［2-4］。GenBank数据库关于APMV-4型的分离毒株信息只有数株，和关研宄非常有限。对于APMV-4的研宄现在已获悉:APMV-4可以从水禽中分离到，可导致病禽的肺炎、

4、支气管炎等呼吸道症状，而且可以在鸡胚和部分细胞上培殖［5,6］。糖基化作为一种主要的翻译后修饰作用对蛋內质的功能有着重要影响;糖基化位点能够参与影响病毒蛋G的合成，进而影响其活性和功能。因此，通过分析比较APMV-1和APMV-4的F和HN蛋白糖基化位点的不同，为两者作用机理的研宄提供科学的理论基础。1材料与方法1.1材料1.1.1毒株及背景资料NDV的GM强毒株、疫苗株LaSota和APMV-4QY毒株均由山东省SPF鸡研宄中心分离鉴定保存。GM强毒株为鸡源基因VII型强毒株，LaSota为基因II型弱毒疫苗株，APMV-4的QY毒株为鸭源弱毒株。1.1.2试剂PCR试剂盒、胶回收

5、试剂盒、载体等均购自宝生物工程(大连)有限公司，SimpleRNAkit购自博日生物有限公司。1.2方法1.2.1引物设计参照GenBank中NDV和APMV4的全基因组序列(No:KU342001和KC439346)设计4对引物，分别用于扩增F和HN全长基因。引物由华大基因公司合成，PAGEplus级别纯化。引物碱基序列名称(5,-3,)APMV1-F1ATGGGCTCCAAACCTTCTACAPMV1-F2TCACGCTCTTGTGGTGGCTCAPMV1-HN1TCCGTTCTACCACATCACCAAPMV1-HN2CGTCTTCCCAACCATCCTAAPMV4-F1GCC

6、GGTTGGGAATGCATCGAArIAPMV4-F2AAGCGGGGATTACGATTTTTAAPMV4-HN1CGCCCCACAATGTCCAATCAGAPMV4-HN2CTTGGITATCCCCCTGCAGAGT1.2.2RNA的提取和反转录GM、LaSota、QY毒株的病毒RNA的提取按照SimpleRNA试剂盒使用操作说明进行，最后用20ylDEPC水溶解RNA,立即进行RT操作。反转录RT按照文献U1的操作进行，cDNA产物-20°C保存。1.2.3PCR扩增、连接和验证APMV-1和APMV-4的cDNA产物5u1、2XpfuPCRBuffer(含Mg、dNTPplu

7、s)25u1、pfuDNAPolymerase(5U/Ml)1M1、不同的F和Rprimer(20pmol/u1)各1y1，加水补至50ploPCR反应经摸索确定为:95°C预变性4min;第一步94°C变性60s、第二步48〜52°C退火60s、第三步72°C延伸90s,共进行33个循环;72°C后延伸4min;40C保存。将扩增得到的GM、LaSota,QY的F和順产物纯化后与PMD-19T进行连接、转化、PCK反应验证后，阳性质粒送至华大基因测序。1