黄曲霉毒素检测方法分析

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1、黄曲霉毒素检测方法分析陆春光（黑龙江省中医药科学院黑龙江哈尔滨150036）【】目的：探讨黄曲霉毒素的检测方法。方法：对黄曲霉毒素的检测方法较多，现对荧光反应，产毒株的筛选法，薄层层析法，高效液相色谱法，酶联免疫吸附法进行分析。结果：黄曲霉毒素Bl、B2、G1和G2,在天然被污染的食品中，一般以黄曲霉毒素B1最多，而黄曲霉毒素BI、B2、G1只占很小部分，Bl、G1毒性强，有致癌性。结论：早期研究时根据毒素在薄层板上产生荧光颜色不同，分为黄曲霉毒素B族和G族。由于黄曲霉毒素的剧毒性，强致癌性及存在的广泛性。【关键词】黄曲霉毒素；检测【】R446

2、【】A【】1007-8231（2015）15-0221-02黄曲霉毒素是由黄曲霉产牛.的一种强致癌毒素，黄曲霉毒素主要来源于污染的玉米及花牛.油，黄曲霉毒素的检测方法较多，其生物学方法主要用于检测毒性，如鸡胚、鸭雏、大白鼠、小白鼠试验等，随灌喂毒素的多少及时间而引起动物的中毒死亡或出现肿瘤［1］。黄曲霉毒素还能产生荧光，有人将从含黄曲霉毒性的花生仁中分离出的酵母菌，接种于培养基后，培养基能产生荧光。现对检测方法分析如下。1.荧光反应取白色惰性硅藻土（木身无荧光），可消除菌丝所产生的荧光干扰），180°C干燥灭菌1小时，适量铺于平皿底，混入少量冷

3、却至50°C的琼脂，凝固后倒入适量培养基制成平板，接种菌悬液于半个平板，30°c孵育，当生长良好时将平皿倒置，置紫外灯下观察，有特异的蓝色荧光出现，判为阳性［2］。在薄层层析板上，黄曲霉毒素BI、B2、G1与G2的荧光强度排列次序为：B2>G2>Bl>Gl,用荧光法测定黄曲霉毒素，所用的激发光波长为365毫微米，荧光波长Bl、B2为435毫微米，Gl、G2为465毫微米。1.产毒株的筛选法微栓过筛法：薄层层析法称TCL证实。即将部分净化后的提取液直接上微栓测定，毒素被硅镁型吸附剂或硅胶吸附后，在紫外光下呈蓝紫色荧光环，若无蓝紫

4、色荧光环即为未检出。AM法筛选，TLC法证实：使用Difico公司AM培养基的配方，培养基火菌后，分装无色比色管，用活化的菌种接种，28"C暗处培养。分别在接种后，培养4、7、14天，用cs-930扫描仪测定比色管的荧光强度，荧光强度增加1.00以为筛选阳性。阳性培养物用TLC法（国际标准法）测定和证实黄曲霉毒B1的含量，使每毫升提取液含1.69克培养物，这样最低检出量是12ppb。2.薄层层析法花生或花生制品样品以氯仿或70%丙酮水溶液，或甲醇：水（55:45）体积比，己烷等抽提，获样品抽提液。硅酸柱层析洗脱提纯，洗脱提纯的黄曲霉毒素以硅胶板

5、薄层层析法测定。3.1AOAG方法（GB法）用50g花生或花生制品样品加25ml水，25g硅藻土与250ml氯仿，震荡提取30分钟，过滤获样品提取液。层析朴直径22mm，长300mm:在柱底部加5g无水硫酸钠，再加上氯仿至占容积的一半高度后加入硅胶（粒度0.05〜0.20μm）10g,以氯仿洗柱壁制层析柱，上层加无水硫酸钠，使氯仿存留高度与无水硫酸钠表面相齐，然后加样品提取液（约50ml）,以150ml己烷与150ml乙醚冲洗，最后以150ml甲醇：氯仿（3:97体积比）洗脱黄曲霉毒素，将此溶液收集挥发，加入少量氯仿在硅酸层析板上作薄层层

6、析。展开剂为丙酮：氯仿。注意薄层层析的一些影响因素，如硅胶与硫酸钙的牌号、硅胶颗粒的大小、混入硅胶中硫酸钙比例、硅胶薄层板的厚度及含水量、展开槽中溶剂气体的组成以及展开剂种类等［3】。3.2层析板的制备方法硅胶85g加15g石膏充分混合，取约3g于小研钵内加入约3倍的蒸馏水，用力研磨1〜2分钟搅成糊状后倒入涂布器内推成三张厚约250μm的薄层板，在空气中干燥约15分钟后，或等薄层凝结后，在100°C烘2小吋活化后放干燥器内待用(一般可保存2〜3天)。点样以微量注射器或小毛细管点，注意标准样液约10μl待测液约20μL观察结果可

7、用10〜125瓦紫外灯观察荧光点。1.高效液相色谱法用高压液相色谱(HPLC)测定黄曲霉毒素是近年较普遍应用的方法。4.1仪器高压液相色谱仪(Waters公司生产｝，备奋6000A型泵，420型荧光鉴定器，Ex360nmEm425nm滤光片，U6K进样器，730型数据处理机，柱10μmC1810cm；FSF型样品粉碎机；FZQ-A型分析振荡器；康氏电动振荡器；具活塞玻璃层析管(8×280nm)。4.2黄曲霉毒素(AFT)标准液的制备，准确称取AFTB,纯结晶溶于苯：乙腈(98:2),配成10μg/ml的贮备液，再取出一定

8、体职稀释成10倍，配成lμg/ml的使用液，AFTG1、G2、B2按同法配制，AFTM1用氯仿配制。4.3样品处理玉米、大米、花生经粉碎，过20