dcsignr在人胎盘滋养层细胞中的表达及意义

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1、DCSIGNR在人胎盘滋养层细胞中的表达及意义【摘要】　　目的:探讨DCSIGNR在人胎盘绒毛组织中的定位及在体外培养滋养层细胞上的表达。方法:建立稳定的滋养层细胞原代培养体系,采用免疫组化单染及荧光双染的方法检测不同孕期正常胎盘绒毛组织及体外培养滋养层细胞上DCSIGNR的表达。结果:DCSIGNR主要表达于胎盘滋养层细胞、Hofbauer细胞及胎盘微血管内皮细胞的胞质及包膜,在原代培养的人绒毛膜滋养层细胞中的DCSIGNR的表达与在体组织表达一致。结论:DCSIGNR表达于不同孕期的胎盘组织及体外分离培养滋养层细胞,为研究滋养层细胞上该受体在宫内感染中的作用提供体外实验的细胞

2、学基础。【关键词】滋养层细胞DCSINGR免疫组织化学宫内感染　　[Abstract]AIM:TostudytheexpressionofDCSIGNRinhumanplacentaandtrophoblastcellsculturedinvitro,andprovidedabasisforexperimentinvitroaimingtoinvestigatethemechanismofreceptormediatedintrauterinetransmission.METHODS:Primaryculturesystemofhumanchorionictrophoblastcells

3、inedbyImmunohistochemistry(IHC)stain.RESULTS:DCSIGNRainlyexpressedinthemembraneandplasminplacentaltrophoblastcells,Hofbauercellsandplacentalvascularendothelialcells.CONCLUSION:TheexpressionofDCSIGNRinhumanplacentaandtrophoblastcellsculturedinvitroisdeterminedbyIHC;Thestudyprovidesacellularbasisfo

4、rexperimentinvitroaimingtoinvestigatethemechanismofreceptormediatedintrauterinetransmission.　　[Key3),立即用组织体积20倍的40g/L多聚甲醛液固定,石蜡包埋(温度低于60℃)、连续切片(厚度6～7μm),用于免疫组化检测。　　1.2方法　　1.2.1滋养层细胞的分离及鉴定采用胰蛋白酶/DNase序贯消化法行人绒毛膜滋养层细胞的分离;用35%～45%的不连续Percoll密度梯度离心方法纯化细胞;抗细胞角蛋白7（CK7）抗体对分离纯化细胞进行鉴定[3]。　　1.2.2免疫组化单染、荧光双染检

5、测DCSIGNR(1)不同孕期胎盘绒毛组织DCSIGNR染色:石蜡切片烤片(58～60)℃1h;经二甲苯、梯度酒精脱蜡至水;30mL/L过氧化氢37℃处理切片20min,封闭内源性过氧化物酶;蒸馏水冲洗,0.01mol/LPBS(pH7.2～7.4)漂洗3次,每次5min;按照一抗要求对组织行预处理;0.01mol/LPBS(pH7.2～7.4)漂洗3次,每次5min;正常山羊血清37℃孵育15min,倾去,不洗;滴加一抗(抗DCSIGNR抗体1∶400稀释),湿盒内孵育,4℃过夜;0.01mol/LPBS(pH7.2～7.4)漂洗3次,每次5min;生物素化二抗37℃孵育15min;

6、0.01mol/LPBS(pH7.2～7.4)漂洗3次,每次5min;辣根酶标记链霉卵白素37℃孵育15min;0.01mol/LPBS(pH7.2～7.4)漂洗3次,每次5min;DAB显色。新鲜配制显色液室温下显色,显微镜下观察至染色深浅合适时自来水洗涤终止显色苏木素复染1min,自来水冲洗,镜下观察,颜色较深可用稀盐酸酒精分色1～2s,自来水冲洗;系列酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片,镜检并照相记录。对照实验用PBS代替一抗作为空白对照。(2)免疫组化单染结果显示CK7(鼠抗人)、DCSIGNR(羊抗人)的定位相同(均在胞质),且两种一抗的种属不同,适用于免疫荧光双重染色。主要步骤

7、如下:切片脱蜡水化;PBS冲洗3次,每次5min;滴加一抗混合液(鼠抗人CK7抗体1∶50稀释＋羊抗人DCSIGNR抗体1∶100稀释),4℃湿盒过夜;PBS冲洗3次,每次5min;滴加荧光二抗混合液(FITC标记山羊抗小鼠荧光抗体1∶50+TRITC标记兔抗山羊荧光抗体1∶50),湿盒避光,37℃孵育45min;PBS冲洗3次(避光),每次5min;封片,激光扫描共聚焦显微镜下观察、拍照。对照实验用PBS