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1、免疫细胞分泌研究进展 摘要：细胞分泌活动涉及一系列复杂的分子活动和信号转导过程,它是许多重要生命活动如神经递质的释放、内分泌激素分泌、蛋白质转运等的基础。故而有关细胞分泌活动的研究近年在国际上形成一个新的热点。有关免疫细胞中细胞因子的分泌机制研究的较少,将膜电容测量、电化学测量、光学测量、胞内信号分子光解等近年发展起来的生物物理方法引入免疫学领域,对研究免疫细胞的分泌调控和信号转导意义重大。细胞分泌活动是生物体信息传递和细胞功能的基本过程之一,如神经系统中神经递质和激素的分泌、免疫系统中细胞因子和抗体的分泌等。细胞分泌活动涉及一系列复杂的分子活动
2、和信号转导过程,随着新技术尤其是细胞分泌检测技术的不断出现,这一过程正在被逐步揭示出来。目前对神经递质释放的研究已经很深入,而对免疫细胞分泌活动尤其是细胞因子分泌的动力学和分泌调控机制的研究则相对较少。将膜电容测量、电化学测量、光学测量、细胞内信号分子光解等生物物理方法引入免疫学领域,可能为免疫细胞分泌的调控和信号转导研究提供大量有意义的数据,从而尽快填补该领域的研究空白。 1单细胞分泌实时测量的新方法 细胞分泌活动的传统研究方法主要采用ELISA、RIA、FACS等阶段性定量测定或冰冻蚀刻电镜技术、普通光学显微镜技术等形态学研究方法,都属于非
3、现场静态研究,并且是大量细胞共同3期娄雪林等:免疫细胞分泌研究进展生理学报ActaPhysiol.Sin.54卷测定。近年来,各种实时监测技术的发展极大地促进了人们对细胞分泌机制的了解。下面就目前常用的三种细胞分泌实时检测技术的原理、方法以及优缺点作简要介绍。 1.1膜电容测量 近10年来,膜电容检测技术在研究细胞胞吐和胞饮机制方面得到了越来越广泛的应用［1］。细胞分泌的最后一步是囊泡膜与胞浆膜融合的过程,当分泌发生时细胞膜的表面积会增加,而细胞膜的电容大小正比于细胞膜的表面积(～1μF/cm2),因此细胞膜电容的增加就代表细胞分泌量。这种技术
4、对囊泡分泌的时间分辨率极高(～ms),常用来研究分泌事件与离子通道活动以及细胞内第二信使的关系。最近出现的细胞贴附膜片电容技术,膜电容分辨率可达到0.1fF,能检测到直径60nm的小囊泡分泌［2］。这一方法为研究单个小囊泡的分泌活动如膜融合孔开闭动力学、膜融合事件的分子调控等提供了强有力的工具。由于胞吐后囊泡膜的回收会导致膜电容的减少,因此膜电容检测技术也能提供囊泡胞饮过程的信息。 膜电容测量技术可用于神经细胞、内分泌细胞、免疫细胞等大多数细胞的分泌测量,而且测量精度和时间分辨率都较高,但该方法不能排除胞吞对胞吐检测的影响,并且对试验条件如封接电
5、阻(Rm)、串联电阻(Rs)的要求很高,对于一些较复杂结构如神经轴突终末、与周边细胞有电学偶联的细胞等则不能用该技术进行研究。 1.2电化学测量 用电化学技术监测细胞分泌的原理是:在电极尖端表面施加一定的电压,容易氧化的化学信使物质就会在电极尖端释放出电子而发生氧化,电极可获得电子并产生一定的电流［3］。微电极的电流大小与电极尖端面积和实验类型有关,一般在pA到nA范围,通常采用膜片钳放大器等低噪声仪器进行检测。对单个分泌电流峰积分即可估算出每个囊泡中包含的递质分子数,即量子包装的大小。施加的电压可为恒电位或三角波循环电压,前者的优点是时间分辨
6、率高,后者的优点是能区分不同的信息分子。在单细胞胞吐测量时两种方法可以互相补充。目前儿茶酚胺、5-HT、胰岛素、组胺、nO以及含色氨酸或酪氨酸残基的多肽激素或递质都可直接或间接地使用该方法检测［16］。 电化学技术监测分泌的最大优点是时间分辨率高(ms级),能监测单个囊泡的释放以及囊泡中的递质含量,且较膜电容测量更为直观;其次具有一定的细胞空间分辨率,可用于测定细胞释放热区(hotspot);另外,该方法对细胞无损伤,可进行长时间监测。但是电极只能检测到少部分信息物质(10％左右),而且对于那些不能被氧化的物质的释放不能直接检测［16］。本方法常
7、与膜电容方法联合应用来研究分泌事件,以相互补充。 1.3细胞分泌的光学测量 用普通光学显微镜只能检测巨大囊泡的分泌过程,而新的荧光染料的开发和显微成像技术的发展使实时监测小囊泡的分泌成为可能［4］。FM1-43和FM4-64等是有效的研究分泌活动的选择性膜表面荧光标记物,它们在水相中没有荧光,当它们插入脂质膜后则显示较强的荧光,囊泡膜胞吐后会使细胞表面荧光增加,而胞吞回收的囊泡因吞进细胞周围的染料而被荧光标记,这样便能够实时观察细胞的胞吐及胞吞过程。本方法的缺点是背景荧光较大,fM染料目前尚不能用于脑片等组织切片的分泌研究。另一种方法是通过基因
8、转染方法将荧光基因如绿色荧光蛋白(GFP)基因转入靶细胞中并选择性地在囊泡中表达,然后用激光扫描共聚焦荧光显微镜等检测囊泡
