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1、免疫细胞分泌研究进展论文.freel2),因此细胞膜电容的增加就代表细胞分泌量。这种技术对囊泡分泌的时间分辨率极高(～ms),常用来研究分泌事件与离子通道活动以及细胞内第二信使的关系。最近出现的细胞贴附膜片电容技术,膜电容分辨率可达到0.1fF,能检测到直径60nm的小囊泡分泌［2］。这一方法为研究单个小囊泡的分泌活动如膜融合孔开闭动力学、膜融合事件的分子调控等提供了强有力的工具。由于胞吐后囊泡膜的回收会导致膜电容的减少,因此膜电容检测技术也能提供囊泡胞饮过程的信息。膜电容测量技术可用于神经细胞、
2、内分泌细胞、免疫细胞等大多数细胞的分泌测量,而且测量精度和时间分辨率都较高,但该方法不能排除胞吞对胞吐检测的影响,并且对试验条件如封接电阻(Rm)、串联电阻(Rs)的要求很高,对于一些较复杂结构如神经轴突终末、与周边细胞有电学偶联的细胞等则不能用该技术进行研究。1.2电化学测量用电化学技术监测细胞分泌的原理是:在电极尖端表面施加一定的电压,容易氧化的化学信使物质就会在电极尖端释放出电子而发生氧化,电极可获得电子并产生一定的电流［3］。微电极的电流大小与电极尖端面积和实验类型有关,一般在pA到nA范
3、围,通常采用膜片钳放大器等低噪声仪器进行检测。对单个分泌电流峰积分即可估算出每个囊泡中包含的递质分子数,即量子包装的大小。施加的电压可为恒电位或三角波循环电压,前者的优点是时间分辨率高,后者的优点是能区分不同的信息分子。在单细胞胞吐测量时两种方法可以互相补充。目前儿茶酚胺、5-HT、胰岛素、组胺、nO以及含色氨酸或酪氨酸残基的多肽激素或递质都可直接或间接地使用该方法检测［16］。电化学技术监测分泌的最大优点是时间分辨率高(ms级),能监测单个囊泡的释放以及囊泡中的递质含量,且较膜电容测量更为直观;
4、其次具有一定的细胞空间分辨率,可用于测定细胞释放热区(hotspot);另外,该方法对细胞无损伤,可进行长时间监测。但是电极只能检测到少部分信息物质(10％左右),而且对于那些不能被氧化的物质的释放不能直接检测［16］。本方法常与膜电容方法联合应用来研究分泌事件,以相互补充。1.3细胞分泌的光学测量用普通光学显微镜只能检测巨大囊泡的分泌过程,而新的荧光染料的开发和显微成像技术的发展使实时监测小囊泡的分泌成为可能［4］。FM1-43和FM4-64等是有效的研究分泌活动的选择性膜表面荧光标记物,它们在
5、水相中没有荧光,当它们插入脂质膜后则显示较强的荧光,囊泡膜胞吐后会使细胞表面荧光增加,而胞吞回收的囊泡因吞进细胞周围的染料而被荧光标记,这样便能够实时观察细胞的胞吐及胞吞过程。本方法的缺点是背景荧光较大,fM染料目前尚不能用于脑片等组织切片的分泌研究。另一种方法是通过基因转染方法将荧光基因如绿色荧光蛋白(GFP)基因转入靶细胞中并选择性地在囊泡中表达,然后用激光扫描共聚焦荧光显微镜等检测囊泡的运动过程［5］。例如,将GFP基因与囊泡特异的前胰岛素基因整合后转入胰岛INS-1β-细胞中进行表达,然后
6、用荧光成像技术实时研究活分泌囊泡的转移、锚定和胞吐过程。此外还有免疫荧光标记法:多巴胺β羟化酶(DBH)在嗜铬细胞分泌囊泡中是一种主要的膜蛋白,由于它在胞吐中会出现在细胞膜的表面,随着它与胞外液中荧光标记的DBH抗体的结合,就能观察到胞吐位点在细胞膜上的分布以及囊泡膜的回收过程。1.4胞内信号分子光解方法细胞分泌活动受很多因素的调控,采用信使物质瞬时释放的方法［6］,可以定量研究各因素对分泌的影响。神经递质的分泌与细胞钙离子浓度紧密偶联(与钙离子浓度的3～4次方成正相关)。Ca2＋螯合物DM-ni
7、trophen和NitrophenyleGTA可用于快速而均匀地提升细胞内钙离子浓度,将这些物质与Ca2+染料通过膜片钳电极或孵育的方法导入细胞内,然后经高能量的紫外光激发,便能产生一个迅速的、阶跃性的钙升高,并且整个细胞钙浓度都会均一地升高。这克服了单纯电刺激引起的离子通道附近产生不同的钙微区的缺点。DM-nitrophen在光解前对Ca2+有很高的亲和力,对静息的细胞钙缓冲几乎没有影响,是研究细胞钙缓冲和钙稳态系统的非常理想的材料。通过控制激发紫外光的强度,可以用来进行细胞内钙离子浓度滴定,也
8、可用于钙结合力测定以及其他许多钙依赖的细胞功能活动。但是它易受Mg2+结合的影响。而NitrophenylEGTA对Ca2+有更高的选择性,但它在光解前对Ca2+亲和力较低,且不易被光解产生大的Ca2+阶跃。除了Ca2+外,许多第二信使如cAMP等都可用该方法对其细胞内浓度进行精确控制。2免疫细胞分泌的细胞和分子机制2.1免疫细胞的离子通道和细胞功能免疫细胞不属于可兴奋性细胞(如神经细胞、肌肉细胞等)之列,但也具有某些与神经细胞相类似的电生理特性。离子通道的活动与离子跨膜流动、膜电
