鼠抗人tcr-cd3单克隆抗体的制备及其初步应用

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1、鼠抗人TCR/CD3单克隆抗体的制备及其初步应用作者：陈宏远,芮雯,花文峰，杜军,蔡绍晖【摘要】目的应用B淋巴细胞杂交瘤技术，制备鼠抗人CD3单克隆抗体，并用于T淋巴细胞亚类检测。方法以本室纯化的CD3蛋白免疫Balb/c小鼠，取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，成功地获得1株抗人CD3单克隆抗体。经间接ELISA测定，杂交瘤细胞培养腹水的抗体效价。结合SDSPAGE实验考察单克隆抗体对CD3促T淋巴细胞增殖活性的作用。结果杂交瘤细胞培养腹水的抗体含量为20mg/mL，效价为10-7，并对T淋巴细胞有促增殖活性，检测正常人外周血阳性T细胞百分率为(73±7)％

2、。结论制备的抗人CD3单克隆抗体具备较高的纯度和活性，可用于T细胞亚类的检测。【关键词】CD3；单克隆抗体；杂交瘤Abstract:ObjectiveTodetecttheCD3positiveTlymphocytessubgrouponoclonalantibodyofmouseantihumanCD3antigenofTlymphocytephocytehybridomatechnique.MethodsBalb/cmicemunizedixedSP2/0myelomaice,thenobtainedanantihumanCD3antigenofhybridom

3、acellline.TheasciticculturemonoclonalantibodytiterinedbyindirectELISA,thequantityandmolecularinedbySDSPAGE.MTTmethodotingTlymphocyteproliferation.ResultsThemonoclonalantibodyquantityofascitichybridomacellg/mLandthetiterotingTlymphocyteproliferation,percentageofTlymphocyteinhealthyadult

4、peripheralbloodsamplesonoclonalantibodyhadhighpurityandactivitythatmightbeusedinthedetectionofCD3positiveTlymphocytessubgroup,andcouldbeappliedinTlymphocytedetection.Keyonoclonalantibody;hybridomasCD3是T淋巴细胞的一个分化抗原，表达于所有成熟T细胞表面，它是由5条肽链非共价结合组成的复合分子，分别称为γ、δ、ε、ζ和η链。其与TCR分子以非共价结合形成一个TCR/CD3复合

5、受体分子，其中TCR是识别异种抗原和自身MHC分子多态性决定族的受体，而CD3分子并不参与抗原识别，它具有稳定TCR结构和传递活化信号的作用。TCR/CD3复合体是T细胞功能和特异性的主要调节者，抗TCR/CD3单克隆抗体已在基础研究和临床中都被广泛应用。如何制备质量好、产量高的单克隆抗体是当前各有关实验室研究的重要问题。目前用于生产单克隆抗体的方法有2种：利用纯系小鼠生产免疫腹水法和杂交瘤细胞常规体外培养法［1,2］。鉴于本次试验样品备用于后续的研发，以及腹水法易保持生物学活性、耗时短和易操作等优点，故应用B淋巴细胞杂交瘤技术联合腹水法，制备并筛选了1株抗人CD3单克

6、隆抗体，并对其特性进行了鉴定和检测，获得较为满意的结果，现报道如下。1材料与方法1.1材料1.1.1纯化抗原、抗体与试剂/盒CD3抗原利用基因重组技术制备，由本室纯化并提供。鼠抗人CD3单克隆抗体及羊抗鼠IgG抗体,APAAPKit为Sigma公司产品，50％(φ)聚乙二醇（PEG,MI1640培养液（含10％新生小牛血清）、无血清RPMI1640培养液、HAT培养液和HT培养液由Gibico公司提供。1.2方法1.2.1免疫小鼠和骨髓瘤细胞准备将CD3纯品的蛋白浓度调整为1mg/mL,取0.4mL与等量的福氏完全佐剂混合、乳化,注射于Balb/C小鼠腹腔，每只小鼠0.

7、2mL。2周后，同样剂量的CD3与等量的福氏不完全佐剂混合、乳化,加强免疫。融合前3d，尾静脉注射100μgCD3蛋白。将小鼠骨髓瘤细胞用完全RPMI1640培养液在培养瓶中进行扩大培养。选择生长旺盛、活力大于95％的骨髓瘤细胞，收集于50mL离心管中，1000r/min离心15min。弃上清液，沉淀细胞用无血清RPMI1640培养液洗涤2次，1000r/min离心15min。用无血清RPMI1640培养液重悬末次沉淀细胞，计数活细胞，配成1×106细胞/mL，以备融合使用。1.2.2免疫小鼠脾细胞悬液的制备无菌条件下取免疫小鼠脾脏，置培