人脂肪干细胞体外培养及向软骨细胞诱导分化的实验研究

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1、人脂肪干细胞体外培养及向软骨细胞诱导分化的实验研究：王中兴，鹿均先，熊传芝【摘要】目的：观察人脂肪基质干细胞（ADSCs）体外分离培养及成脂、成软骨诱导分化的生物学性状，探讨其作为软骨组织工程种子细胞的可行性。方法：（1）人脂肪组织于健康成年女性腹部吸脂术，酶消化法分离出ADSCs,体外培养扩增。（2）取第3代ADSCs,测细胞生长曲线,流式细胞仪测原代细胞表面标记；成脂和成软骨诱导分化。（3）倒置显微镜观察油红O、阿尔辛蓝（ABPSA）染色和Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色检测分化情况；RTPCR检测相关标志基因表

2、达。结果：（1）体外培养的ADSCs细胞形态均一,传代稳定。（2）经成脂诱导,细胞内出现空泡,油红O染色呈红色,RTPCR检测到有Leptin、PPARγ表达；经成软骨诱导,ABPSA染色呈紫红色,Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色胞浆呈棕黄色,RTPCR检测COLLⅡ、SOX9和aggrecan表达。结论:脂肪干细胞能向软骨细胞方向诱导分化,可作为软骨组织工程种子细胞。【关键词】脂肪基质干细胞;分化;软骨;组织工程近年来组织工程学发展迅速，为骨科治疗顽疾带来了新的希望，但是如何获得大量的种子细胞却一直制约其发展，

3、通常骨组织工程所用的骨髓基质干细胞（BMCs）由于难以分离和培养，限制了其成为良好的组织工程种子细胞。本实验通过对成人皮下脂肪组织干细胞的分离、培养、鉴定及向软骨定向诱导，以期建立获取脂肪干细胞和诱导其向软骨细胞分化的方法，为组织工程软骨的构建提供新的种子细胞。1材料和方法1.1材料本实验所用脂肪组织来自于东南大学医学院附属徐州医院整形外科腹部吸脂者，均为女性，年龄20～45岁。Ⅰ型胶原酶为美国EM粉剂为GIBCO公司产品，胎牛血清(FBS)为HYCLONE公司产品，兔抗人Ⅱ型胶原多克隆抗体及免疫组化试剂盒购自北

4、京中杉金桥生物技术有限公司,逆转录试剂盒购自日本TaKaRa公司。1.2方法1.2.1脂肪基质干细胞（adiposederivedstemcells，ADSCs）的分离培养无菌条件下取脂肪组织，0.075%Ⅰ型胶原蛋白酶消化（放入37℃震颤水浴槽中60min），1200×g离心10min，去除漂浮的脂肪细胞及上清液，DMEM培养液（含10％胎牛血清、100μg·ml-1青霉素和100μg·ml-1链霉素）重悬细胞，接种至培养皿中，以3×104个有核细胞·cm-2密度接种，在37℃、5%CO2、饱和湿度为100％的

5、培养箱中孵育，48h后首次换液，弃去未贴壁细胞。细胞生长至75％～90％融合时传代，每2～3d更换培养液。1.2.2MTT法测生长曲线取第3代细胞消化制备成单细胞悬液，调整细胞悬液浓度为1×107L-1,接种于24孔板,每孔接种1ml,分8组,每组3孔,共24孔。每天计数1组，取3个孔的均值。绘制细胞生长曲线，计算细胞群体倍增时间。1.2.3向脂肪细胞诱导（1）取第3代细胞,以4.0×107L-1密度接种于预先放置了小玻片的24孔板,置于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内培养。待细胞爬满玻片后用成脂诱导培养基(

6、高糖DMEM、10%胎牛血清、0.5mmol·L-1IBMX、1μmol·L-1地塞米松,10μmol·L-1胰岛素、1%青链霉素原液)诱导分化2周，每72h换液1次，相差显微镜观察。（2）成脂特性检测：取成脂诱导2周后的玻片，10%甲醛溶液固定10min后水洗，于60%异丙醇溶液内侵洗。油红O染液染色10～15min，双蒸水内洗,甘油明胶封固，显微镜下观察，RTPCR检测相关标志基因表达情况。1.2.4向成软骨诱导（1）取接种于25cm2培养瓶培养至第3代的细胞,用成软骨诱导培养基(高糖DMEM、1%胎牛血清

7、、10μg·L-1TGFβ1、50nmol·L-1抗坏血酸、6.25mg·L-1胰岛素、1%青链霉素原液)诱导分化2周,相差显微镜观察。（2）成软骨特性检测。阿尔辛蓝（ABPSA）染色：4%多聚甲醛固定细胞，AlcianBlue染液(AlcianBlue1.0g、蒸馏水97ml、冰醋酸3ml)孵育30min，蒸馏水洗,1%过碘酸水溶液氧化5～10min，Schiff试剂染20min,苏木精染核,甘油明胶封固。Ⅱ型胶原免疫组织化学染色：4%多聚甲醛固定细胞，蒸馏水洗,加0.2U·ml-1软骨素酶ABC，37℃孵

8、育30min,加3%H2O2甲醇去除内源性过氧化氢酶的作用,蒸馏水洗,加5%BSA室温作用20min,加1∶100稀释的兔抗人Ⅱ型胶原多克隆抗体,4℃孵育过夜。按试剂盒说明依次加入二抗、SABC和DAB显色,苏木精对比染色。RTPCR检测相关标志基因表达情况。2结果2.1原代ADSCs形态学观察细胞接种后24h开始贴壁，初为小圆形，直径5μm，色深。48h后大部分细胞已