基因组dna的提取及电泳鉴定

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1、分子生物学实验1、欢迎大家参加分生实验的学习；2、学习分生实验的重要性；3、守纪律，听老师安排，穿白衣；4、每组做一份实验4、本课件原则上禁止拷贝，要作好记录;5、关于课间休息和上课时间每天实验结束应主动整理实验台。值日安排。实验课考试1.最后2学时进行实验课考试2.开卷,内容为实验课学习内容。一、加样器的使用及注意事项1、用途2、如何使用？2.1根据取样量，选择合适的加样器。5ul、50ul、500ul，应选择哪个加样器?顶部标有加样器的最大量程，分别为：20ul:0.5~20l100/200ul:20~10

2、0/200l1000ul:200ul~1000l实验仪器的使用及注意事项练习：加样器读数为100，实际体积各为多少?2.2如何调节？(1)首先观察目前读数,假设为050:1000l:500l100/200l:50l20l：5l(2)顺时针调节---读数变小逆时针调节---读数变大(3)注意：调节前加样器读数正处于最大量程或最小量程时，如果向错误方向调节，马上会超出量程，将会损害加样器的精度。2.3加样器使用步骤(示教及学生练习)：1）选择加样器,观察读数,调节读数，吸头的安装要紧密。不要用手直接拿

3、吸头，安上吸头后一定要再固定一下。2）吸取液体前，先打到第一挡。3）将吸头插入液面下适当深度，过深可能会腐蚀加样器,过浅可能会吸入空气。4）缓慢松开拇指,吸取液体。松开过快，液体上冲会腐蚀加样器;完全放开拇指后，停留约半秒钟,急于离开液面，容易吸入空气。5）抬起加样器,估计体积是否正确,将外壁液体用容器口引流回去6）(吸头内有液体时，不能将加样器倒置或平放，以防液体倒流损坏加样器！),贴容器内壁，将液体匀速打出，加样器推到第二挡。观察吸头内液体是否完全打出并立即弃于废物盒内.1、打开电源2、离心管中的液体为2/3

4、,盖紧盖子,防止离心机被腐蚀。二、离心机的使用注意事项1代表转速盘上方的数据，2代表下方的数据。3、样品配平,对称放入离心机(管的连接处朝外).4、设定离心时间(如设定2分钟，可定时多点时间，再用手表记时)。5、统一离心，逐渐升到要求转速。实验一、真核细胞基因组DNA的提取、酶切及电泳实验目的1.掌握人外周血基因组DNA的提取技术。2.学习酶切技术3.学习DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和技术。第一部分：裂解血细胞、蛋白酶k消化第二部分:酚氯仿抽提、乙醇沉淀第三部分：酶切、DNA电泳实验内容（到8：30~8:40）

5、1）取0.3ml抗凝血置于1.5mlEppendorf管中.2）加入1mlSTMT溶液，充分混匀，静置5min，使其溶血。3）9,000rpm,离心3分钟(统一离心)。4）弃上清。弹管底重悬沉淀。注意:离心时离心机内样品要平衡实验步骤实验第一部分：裂解红细胞、蛋白酶K消化8：40~9：15STMT溶液：S:Sugar8%T:TritonX-1001%M:MgCl20.5mMT:Tris-HCl10mM(PH:8.0)作用：用Triton细胞膜上打孔，裂解细胞。4）加0.4ml生理盐水，悬浮细胞。5）9000rpm

6、,离心3分钟(统一离心)，弃上清，弹匀。6）加460lNE溶液，混匀。7）加30l10%SDS,迅速混匀。8）加50l蛋白酶K(20mg/ml),混匀，置50°C水浴1小时。操作注意事项：1、混匀时确认沉淀已被悬起。2、注意30ul、50ul加样体积准确。作用：a.阴离子型去污剂，溶解细胞膜、核膜上脂质成分b.使蛋白质变性c.将细胞膜、核膜破坏；对核酸酶有抑制作用N:NaCl50mME:EDTA.Na225mM(PH:8.0)作用：金属离子螯合剂，抑制DNase的活性(螯合DNase发挥活性所需的2价阳离子

7、)。各种试剂的作用1、NE溶液：2、SDS：十二烷基硫酸钠终浓度0.5%3、蛋白酶K(或链霉蛋白酶)是广谱蛋白酶，能在SDS和EDTA的存在下保持很高的活性，降解蛋白质，将DNA游离。一、核酸提取的主要步骤课间介绍真核细胞基因组在提取过程中一般有以下几步:1)破碎细胞；2)去除蛋白质，糖类等等生物大分子；由于真核细胞基因组较大，在纯化出的ＤＮＡ的操作中应注意动作轻柔，且在低温下进行，以最大限度地减少机械和化学作用对ＤＮＡ的剪切，从而获得相对完整的ＤＮＡ3)沉淀核酸乙醇沉淀SDS裂解蛋白酶K消化琼脂糖电泳PCRDN

8、A提取步骤图解酚氯仿抽提重蒸酚:酚的作用是变性蛋白质，而对DNA结构没有影响。无色酚的氧化产物(如醌等,粉红色)破坏磷酸二脂键。重蒸酚是将酚中的酚的氧化产物去除。TE溶液:Tris-HCl10mM(pH:8.0)EDTA.Na21mM(pH:8.0)作用：提供略碱的pH值，保证DNA溶于水相。在酸性条件下，DNA分配于有机相。8-羟基喹啉：0.1%黄色酚相指示剂抗氧化剂作