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1、第一部分:基因组DNA的提取及常见的问题第二部分:RNA的提取及常见的问题基因组DNA的用途DNA是遗传信息的载体,是最重要的生物信息分子,是分子生物学研究的主要对象.为了进行测序,杂交和基因的表达,获得高分子量和高纯度的基因组DNA是非常重要的前提.基因组DNA提取的原则保证提取的DNA具有一定的长度纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质排除有机溶剂和金属离子的污染蛋白质,多糖,脂类等降低到最低程度排除其他核酸分子的污染基因组DNA-CTAB法CTAB法原理(植物DNA提取经典方法)CTAB(hexadecyltrimethylammoniumbromide,十六烷基三甲基溴化铵)
2、,是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性.在高离子强度的溶液中(>0.7mol/LNaCl),CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物,只是不能沉淀核酸.通过有机溶剂抽提,去除蛋白,多糖,酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来.注:CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出,因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热,且离心时温度不要低于15℃.基因组DNA-CTAB法CTAB提取缓冲液的经典配方Tris-HCl(pH8.0)提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏;EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制DNase活性;NaCl提供一个高盐环境,使DNP充分溶解
3、,存在于液相中;CTAB溶解细胞膜,并结合核酸,使核酸便于分离;β-巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除基因组DNA-CTAB法CTAB提取缓冲液的改进配方PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物,能与多酚形成一种不溶的络合物质,有效去除多酚,减少DNA中酚的污染;同时它也能和多糖结合,有效去除多糖.基因组DNA-其它方法物理方式:玻璃珠法,超声波法,研磨法,冻融法化学方式:异硫氰酸胍法,碱裂解法生物方式:酶法根据细胞裂解方式的不同有:基因组DNA-其它方法吸附材料结合法:根据核酸分离纯化方式的不同有:硅质材料阴离子交换树脂磁珠高盐低pH值结合核酸,低盐高
4、pH值洗脱.快捷高效.低盐高pH值结合核酸,高盐低pH值洗脱.适用于纯度要求高的实验.磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物,从而达到分离目的.基因组DNA-其它方法浓盐法:有机溶剂抽提法:密度梯度离心法:利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同,将二者分离有机溶剂作为蛋白变性剂,同时抑制核酸酶的降解作用利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物DNA提取的基本步骤I.材料准备II.破碎细胞或包膜-内容物释放III.核酸分离,纯化IV.沉淀或吸附核酸,并去除杂质_V.核酸溶解在适量缓冲液或水中材料准备和裂解最好使用新鲜材料,植物组织应尽量选取不含油脂,蜡质和真菌感染的部位,保证材料
5、基因组的单一.低温保存的样品材料不要反复冻融提取血液基因组DNA时,要选择有核细胞(白细胞);组培细胞培养时间不能过长,否则会造成DNA降解;含病毒的液体材料DNA含量较少,提取前先富集基因组DNA的提取细胞裂解材料应适量,过多会影响裂解,导致DNA量少,纯度低针对不同材料,选择适当的裂解预处理方式:植物材料--液氮研磨,干种子可以在室温研磨或用粉碎动物组织--匀浆或液氮研磨组培细胞--无需预处理细菌--溶菌酶破壁酵母--破壁酶或玻璃珠需要用蛋白酶K高温温浴时,定时轻柔振荡基因组DNA的提取核酸分离,纯化采用吸附材料吸附的方式分离DNA时,应提供相应的缓冲体系采用有机(酚/氯仿)
6、抽提时应充分混匀,但动作要轻柔离心分离两相时,应保证一定的转速和时间针对不同材料的特点,在提取过程中辅以相应的去杂质的方法基因组DNA的提取核酸分离,纯化蛋白质的去除:酚/氯仿抽提使用变性剂变性(SDS,异硫氰酸胍等)高盐洗涤蛋白酶处理核酸分离,纯化多糖的去除:高盐法:用乙醇沉淀时,在待沉淀溶液中加入1/2体积的5MNaCl,高盐可溶解多糖.用多糖水解酶将多糖降解.在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积),氯苯可以与多糖的羟基作用,从而去除多糖.用PEG8000代替乙醇沉淀DNA:在500μLDNA液中加入200μl20%PEG8000(含1.2MNaCl),冰浴20min.核
7、酸分离,纯化多酚的去除:在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂:β-巯基乙醇,抗坏血酸,半胱氨酸,二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂:如PVP(聚乙烯吡咯酮),PEG(聚乙二醇),它们与酚类有较强的亲和力,可防止酚类与DNA的结合盐离子的去除:70%的乙醇洗涤核酸吸附,沉淀和溶解使用合适的吸附材料吸附核酸,其它的杂质均被洗掉,达到纯化DNA的目的另一种方式加入1/10体积的NaAc(pH5.2,3M),用预冷的乙醇或异丙醇沉淀RNA吸附或沉淀后应用70%的乙醇洗涤,以除去盐离子等若长期
