鸡γ干扰素基因的克隆和表达及其多克隆抗体的制备

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1、东北农业大学硕士学位论文鸡γ干扰素基因的克隆和表达及其多克隆抗体的制备姓名：丁忠庆申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：宋铭忻2003.6.1摘要Y．干扰素(Interferon，y、IFN—y)主要由滢忱的T鲴腿及NK细腿产生，具礴抗病毒作带，也其有上调MHCIl(majorhistoeompatibilityeomptex，MHC)类抗琢分子的表达等作麓，是影响机体细胞免疫和体液免疫反应的一类具有多种调节效应的细胞因子。本试验根据鬻辨已发袭豹序列，设计一对；

2、物，琏耀逆转聚．聚合酶链式爱巍(Re

3、vel's}traascrlption-potymerasechainreaction，RT-PCR)技术，从刀豆素A(ConeanavatinA，ConA、诱导培莽24h的鹏脾淋巴细胞中扩增得到了大小约500bp的基因，将其连接到pUCl9质粒上，经震粒PCR手珏EcoRl，HindHI霰酶甥鉴定螽，簿选粥性重组毙瘫。序列分辑表鹤，该基蕊阅读开放框架由492个核营酸组成，与马和人IFN．y撼因序列的同源性分别为35％和32％，与鸡I型干扰紊纂因的厨源性仅为25％，与隔，}报道的鸡IFN．y基因序列完全一

4、致。这表明鸡簿海融细脆受委n有丝分裂原刺激螽，其IFN-y基因mRNA获褥了表达。本试验成功克隆榴到了鸡IFN．y基因。憋竟隧褥到的鸡IFN—y基霞亚毙隆戮丈强抒莲擐援表达载热pPROEX“}拜粒Pstl霜Kpnl位点上，构建重组表达质粒pPROEX⋯HT-IFN-Y。经序列分析鉴斑，确证目的基因克隆到载体的预期位点。将重组质粒转化大肠杆菌DH5a，于37"C诱导培莽8h，SDS．PAGE凝胺电滚衰鹈该基戮在大瑟稃蘩孛获褥了蹇水警表达，表达静鸡IFN．￥融含蟹彦分予踅约为22ku。该重组蛋白占菌体总蛋白的

5、33％。经Westernblot浆定，确定该重组骚白为包涵体，具有生物学潘性。该包涵体被6M盐酸胍裂解后，通过镍离予亲和树脂进行了纯化。用掰获得豹重缮鸡IFN*￥融合骚自及其纯纯产物缀三次飘肉注射新西兰白兔。错《备兔抗鸿IFN-Y多克隆抗体。琼脂扩散实验结果表明，多克隆抗体可岛纯化的鸩IFN．Y菔组蛋自发生特异性反应。本次试验残功宠隆、表达、纯毒{：了鸡IFN-￥鞋台甏宣，著；蠡l}鍪了兔撬避IFN-￥多竞隆撬皿清，可望用于端IFN—Y薰组蛋自艇物学特性及其应用的研究中。)。。关键壤鸿；烈”y：基戮究隆；

6、固重缀簧鑫；彳．V*CloningandExpressionoftheChickenY—interferonGeneandthePreparationofPolyclonalAntibodyagainstRecombinantChickenIFN—YAbstractInterferon．yisananfiviralcytokineproducedbyactivatedTeellandNKcell．1tupregulatedMHC珏antigenexpression，influencedthecellula

7、randhumoralimmuneresponseandhaspleiotropicregulatoryeffectsonimmunesystem．Onegenewasamplifiedbyreversetranscription—polymerasechainreaction(RT-PCRlinsplenocyteswhichwasstimulatedwithCorLA．for24hours．ThegenewasclonedintoPUel9vectorandidentifiedwithPCRandEc

8、oRI+HindIIIdigestion．Then．oneofthePOsitiverecombinantclonewassequencedandanalysed．Theresultshowedthati扭sequencewas35％and32％ldenticaltoequineIFN-￥andhumanlFN—yrespectively,butitonlysharedl5％homologywithchickentypeIIFN．Thesequencewasjastthesameasthepublishe

9、dchickenIFN—Ygene．SothechickenIFN一￥mRNAmaybeexpressedinConA-activatedchickensplenocytesandtheIFN·Ygenehadbeenclonedfromchickensplenocytessuccessfully．ThecDNAofchickenIFN-ygenewassubelonedjntoPstIandKpnIsitesofpPROEX