鸡γ干扰素基因的克隆和表达及其多克隆抗体的制备

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东北农业大学硕士学位论文鸡γ干扰素基因的克隆和表达及其多克隆抗体的制备姓名：丁忠庆申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：宋铭忻2003.6.1 摘要Y．干扰素(Interferon，y、IFN—y)主要由滢忱的T鲴腿及NK细腿产生，具礴抗病毒作带，也其有上调MHCIl(majorhistoeompatibilityeomptex，MHC)类抗琢分子的表达等作麓，是影响机体细胞免疫和体液免疫反应的一类具有多种调节效应的细胞因子。本试验根据鬻辨已发袭豹序列，设计一对；|物，琏耀逆转聚．聚合酶链式爱巍(Revel's}traascrlption-potymerasechainreaction，RT-PCR)技术，从刀豆素A(ConeanavatinA，ConA、诱导培莽24h的鹏脾淋巴细胞中扩增得到了大小约500bp的基因，将其连接到pUCl9质粒上，经震粒PCR手珏EcoRl，HindHI霰酶甥鉴定螽，簿选粥性重组毙瘫。序列分辑表鹤，该基蕊阅读开放框架由492个核营酸组成，与马和人IFN．y撼因序列的同源性分别为35％和32％，与鸡I型干扰紊纂因的厨源性仅为25％，与隔，}报道的鸡IFN．y基因序列完全一致。这表明鸡簿海融细脆受委n有丝分裂原刺激螽，其IFN-y基因mRNA获褥了表达。本试验成功克隆榴到了鸡IFN．y基因。憋竟隧褥到的鸡IFN—y基霞亚毙隆戮丈强抒莲擐援表达载热pPROEX“}拜粒Pstl霜Kpnl位点上，构建重组表达质粒pPROEX⋯HT-IFN-Y。经序列分析鉴斑，确证目的基因克隆到载体的预期位点。将重组质粒转化大肠杆菌DH5a，于37"C诱导培莽8h，SDS．PAGE凝胺电滚衰鹈该基戮在大瑟稃蘩孛获褥了蹇水警表达，表达静鸡IFN．￥融含蟹彦分予踅约为22ku。该重组蛋白占菌体总蛋白的33％。经Westernblot浆定，确定该重组骚白为包涵体，具有生物学潘性。该包涵体被6M盐酸胍裂解后，通过镍离予亲和树脂进行了纯化。用掰获得豹重缮鸡IFN*￥融合骚自及其纯纯产物缀三次飘肉注射新西兰白兔。错《备兔抗鸿IFN-Y多克隆抗体。琼脂扩散实验结果表明，多克隆抗体可岛纯化的鸩IFN．Y菔组蛋自发生特异性反应。本次试验残功宠隆、表达、纯毒{：了鸡IFN-￥鞋台甏宣，著；蠡l}鍪了兔撬避IFN-￥多竞隆撬皿清，可望用于端IFN—Y薰组蛋自艇物学特性及其应用的研究中。)。。关键壤鸿；烈”y：基戮究隆；固重缀簧鑫；彳．V* CloningandExpressionoftheChickenY—interferonGeneandthePreparationofPolyclonalAntibodyagainstRecombinantChickenIFN—YAbstractInterferon．yisananfiviralcytokineproducedbyactivatedTeellandNKcell．1tupregulatedMHC珏antigenexpression，influencedthecellularandhumoralimmuneresponseandhaspleiotropicregulatoryeffectsonimmunesystem．Onegenewasamplifiedbyreversetranscription—polymerasechainreaction(RT-PCRlinsplenocyteswhichwasstimulatedwithCorLA．for24hours．ThegenewasclonedintoPUel9vectorandidentifiedwithPCRandEcoRI+HindIIIdigestion．Then．oneofthePOsitiverecombinantclonewassequencedandanalysed．Theresultshowedthati扭sequencewas35％and32％ldenticaltoequineIFN-￥andhumanlFN—yrespectively,butitonlysharedl5％homologywithchickentypeIIFN．ThesequencewasjastthesameasthepublishedchickenIFN—Ygene．SothechickenIFN一￥mRNAmaybeexpressedinConA-activatedchickensplenocytesandtheIFN·Ygenehadbeenclonedfromchickensplenocytessuccessfully．ThecDNAofchickenIFN-ygenewassubelonedjntoPstIandKpnIsitesofpPROEXlMHTvectortoconstructrecombinantplasmidpPROEX'n“HT．IFN—Y．弱erecombinantplasmidwastranslatedjntoE．coliDH5aandthebacteriawasinducedwith!PTG．ItwasdemonstratedbySDS-pAGEandWesternblotthata22kuproteinwhichwasequaltochickenIF'N-￥proteininmolecularweightwasexpressedinE，coilDH5a。ThisproteinwaspurifiedandusedtopreparetheantibodyagainstchickenIFN-yprotein．Theresultshowedthattheantibodycouldreactwithpurifiedrecombinantchicken1FN-￥protein。Candidate：DingzhongqingPreventiveVeterinaryMedicineSupervisor：Vice·ProfessorSongMingxinKeyWords：chicken：IFN-￥；genecloning；expression：protein肌 1引言1．1细胞因子的研究概况1932年，Rich和Lewis发现结核菌素致敏组织中的中性粒细胞和巨噬细胞移动受到抑制，他们首先提出细胞产生的可溶性物质能介导生物活性(孙卫民，1999)。1957年将病毒诱导细胞产生的、能干扰病毒繁殖的可溶性蛋白质称为干扰素(Interferon，IFN)．这是正式命名的第一个(类)细胞因子(Isancs&Lindenmann；1957)。以后人们相继发现，不同物质能刺激淋巴细胞产生多种具有生物学活性的可溶性蛋白质。六十年代将这些由淋巴细胞(主要是T淋巴细胞)产生的、尚未了解生化本质的、具有生物学活性的可溶性蛋白质统称为淋巴因子(Lymphokine)。以后人们又发现，单核巨噬细胞也能产生许多类似的可溶性活性蛋白质，如淋巴细胞活化因子(Lymphocyteactivatingfactor,LAF)等，于是将单核巨噬细胞产生的活性因子称为单核因子(Monokine)。由于许多非淋巴细胞亦可分泌上述淋巴因子和单核因子，于是提出细胞因子(Cytokines)的概念。上世纪七、八十年代是细胞因子研究十分活跃的时期。此阶段研究细胞因子有两个重要的进展：～是细胞因子命名的统一：二是细胞因子的纯化、鉴定方法的发展和基因重组技术的应用。随着生物化学技术的发展和可大量生产天然细胞因子方法的成功，大大提高了分离、纯化和鉴定细胞因子的水平，对细胞因子的理化性状包括分子量、等电点、酶敏感性、在各种理化条件下的稳定性和氨基酸序列等均有了较深入的了解。用高度纯化的细胞因子制备的抗特定细胞因子的特异性抗体(多克隆抗体或单克隆抗体)使人们能确切地鉴定和研究各种细胞因子。重组DNA技术的应用使细胞因子的研究发生了根本的变化。通过基因重组技术，人们可以获得大量均一的基因重组细胞因子，使得细胞因子的鉴定、研究和应用进入了一个新阶段。第一个重组的细胞因子是IFN，关于人和鼠等哺乳动物干扰素基因的研究始于七十年代末(K．Dowkins，1997：许剑琴，1998：G．Conway，1998)。八十年代以来。许多细胞因子被克隆化，新的细胞因子不断被发现。目前已发现的细胞因子有几十种。基因重组技术和其他分子生物学技术的发展和不断完善，使重组细胞因子更接近于天然分子，因此人们能确切地研究各种细胞因子的理化性质、结构和生物学功能：研究细胞因子作用的受体、受体的结构、以及细胞因子受体介导的信号传递过程；研究各种因素对细胞因子的产生和生物学活性的调节；研究细胞因子与疾病的关系及其临床应用价值。对细胞因子的分子结构进行适当加工和改变，可以获得生物学活性更加单一、更加有效、副作用更少的细胞因子，也可以得到细胞因子的有效拮抗剂，更有利于临床使用。人们从细胞因子被发现时就已经开始研究细胞因子与疾病的关系，但直到能够得到大量纯化的天然细胞因子或基因重组细胞因子以后，其临床应用才成为可能。细胞因子用于临床治疗疾病的研究从八十年代开始。1986年第一个得到美国食品和药品管理局(FDA)批准用于临床的细胞因子是IFN-a，至今至少有十个以上的细胞因子在美国、欧洲和世界各地用于临床治疗疾病。细胞因子基因治疗更是目前研究的热门。细胞因子由造血系统、免疫系统或炎症反应中的活性细胞产生．能调节细胞分化、增殖 。一。。，，』垄誊鐾垡鍪譬塑逛—，。—，。；一和诱导细胞发挥作用，是商活性多功簸的多肤、蟹白或糖精自。细胞因子大多数各育翼独特的缴物学功能和广泛的生物学活性。细胞因子的活性很高，在极低浓度TaP能发挥作用·一静绍貔因子紫露毒多弹生魏攀港性，磊誉弱豹纲臆嚣子又霹戆毒辣弱或籀纭麴生物学添挫·许多细胞因子之间可以相互作用，一种细胞因子可以调节翳一种细胞因子的合成和分泌，调控本身或其他细匏因子的受体波达，或影响其他细胞因子的功能。如IFN—Y对肿瘤坏残因子(Tum。rnecrosisfactor，TNF)抗瓣痃纲耱增建静律甭有游簿俸怒稀辩TNF键进戒纤维缩缝增髓的作用则是拮抗的。这种细胞因子之间的相驻诱导、棚互调节、相互拈抗、相加缄协同的作用构成了细胞因子的网终(Network)。细胞城子调节髓络在免痰应答和炎症反应戆发生、发艘和转归以及造疯系统的分纯发育等方面起薷踅要的作用。禽类的细胞因子基因与哺乳动物的细胞因子基因对应部分相比较，其序列同源性低，所表达熬蛋囊蕨与针对螓拿L动物缎憝霆子瓣抗髂交叉反痘小(HKMichael或al，2000)。髫藏，只有9种鸡细胞因予被克隆，I塑(IFN-o邝)和Il型IFN(IFN·Y)、白介素·8(Interleukin一8，IL．8)、IL．2、IL一15、骨髓细胞单核生长因子(Myelomonocyticgrowthfactor，cMGF)、转化生长因子家族(Transforminggrowthfactorfamily，TGF)、予绷麓因予(Stemcellfactor，SCF)、IL．1B、IL．18、IL．6。1．2手挽素匏生物学侔用1957年英国学者发现IFN以来，它～直是细胞因子研究中最为活跃、也是进展最快的领域之一(|saacset采，1957)。lFN是盎动物规薅缓貔或组织凄葬细貔簌疯毒、蔡些纲蔻藏IFN诱生剂作用下分泌的一类低分子量、可溶性糖蛋自，它具有诱导细胞产生抗瘸簿感染的作用，同时在细胞潮子网络中可能对其他细胞因子的表达和激活发挥作用。IFN在基因表达调控的磷究孛毒重簧静意义，蔼显在爨毒病豹教瘸瓿理帮耱翱上蠢骞重要拣经。IFN研究已发震成为与病毒学、细胞学、免疫学、临床医学、分子生物学及肿瘤学研究相关的一个重要分支。一般认为哺乳动物的IFN分为两个激，即I型和II型1FN。煎纛又分为IFN-d、IFN．8、IFN-8、IFN·∞和IFN1等．宙{f】其有稀关的络擒并享用黼～类受俸，薪三种IFN主簧楚对病德的应答产生的，能诱导机体产生抗病毒蛋白。伍、B型IFN有相似的理化性质和生物学功能，妇对热(56℃30min)、酸(pH2)稳定，抗痰毒溪牲强，诱燮M}配I(Majorhistoeompatibil弧complex，MHC)类抗原等。而Il型IFN仅由IFN*Y组成，又称为免疫IFN，是由活化的T淋融细胞在诱生剂的作用下产啦的，与I型IFN不享用同一类受体，对酸、热较敏感，对免疫系统毫调警雩筝羁，是壤巍魂耪弱主要曩噬缎蕤嚣镪爨子(酗嚣c∞砖a薛activatingfactor,MAF)(RE)Schreiberetal，1985)。IFN—Y主疆具有以下的生物学活性；l。2．1千摅素一￥的装瘸毒{睾爰IFN-Y的抗病毒作用有种麟特异性(龚非力，1998)，～般来说，作用于嗣一种属的细胞对落性最强，其种属屏簿比IFN-a、IFN*§严格。IFN—Y诱导2,5-A会戒酶豹缝力甄予IFN-a和IFN·§，不能诱释Nix蛋囱的表达。但是IFN-y能够诱等病毒感染的细胞袭达病毒抗原，增加免疫系统识别和杀伤感染姜棚胞的能力。IFN-Y还能通过其他未知的途径抗病毒繁殖(GKarupiahet撼，1993XQWeietal，1995>。2 引言1．2．2干扰素．y的抗细胞增殖作用与IFN。d和IFN．8相比，IFN．Y也能抑制前癌基因(c．myc、C-fos)的表达。阻止细胞株从G0期进入G1期(孙卫民，1999)：IFN．Y同样也能诱导肿瘤细胞株分化。用IFN—Y处理人A43l细胞后，细胞形态发生改变，继而死亡，其机理可能是诱导了细胞的终末分化。IFN·Y能抑制许多肿瘤细胞株的生长，IL．1可抑制、协同或不影响IFN．Y对这些细胞的生长抑制作用。IFN．Y对另一些肿瘤细胞却有促增殖作用。IFN—Y还能促进其他细胞因子的抗肿瘤作用，使对TNF．a不敏感的细胞转为敏感，两者在亚适剂量合用时即可控制小鼠移植肿瘤的生长。IFN．Y对癌基因转化的细胞也有抑制生长的作用，IFN—Y还能抑制癌基因的表达。IFN．Y的抗肿瘤作用是多方面的，包括多方面抑制肿瘤细胞生长和诱导多方面抗肿瘤的免疫应答。1．2．3干扰素．Y的免疫调节作用IFN-y能显著增加抗原提呈细胞表达MHC．II类抗原的数量，增强抗原提呈细胞与T细胞的相互作用，增加辅助T细胞(T-helpercell，TH)的数量和增强迟发型超敏反应(Delayedtypehypersensity，DTH)(Heathetal。1990：Kaspersetal，1994)。小鼠静脉输注IFN—Y后，巨噬细胞和其他细胞表达MHC．II类抗原增加，其中骨髓细胞的MHC．I类抗原和MHC．II类抗原都有增加。IFN-Y基因敲除的小鼠受卡介苗(BacilleCalmetce．Guedn，BCG)刺激后，巨噬细胞表达MHC—II类抗原显著低于正常小鼠。IFN-Y诱导某些肿瘤细胞表达MHC．II和MHC-I类抗原的作用，促进了此抗原诱导的自身T细胞增加和细胞毒T细胞对肿瘤的杀伤。IFN·Y可增加单核细胞和巨噬细胞表面IgGFc受体数。从而参与调节免疫复合物的清除、吞噬作用和抗体依赖细胞介导的细胞毒(Antibody-dependentcell·medimedcytotoxicity．ADCC)作用。IFN-y具有巨噬细胞活化因子的作用，能引发巨噬细胞的杀肿瘤效应，这是IFN．Y抗肿瘤的机制之一。细胞内寄生微生物感染的巨噬细胞经过IFN．Y诱导后，能够活化并杀灭细胞内的微生物；在IFN·Y处理的巨噬细胞内，活性氧和H202显著增加并持续几天，伴有细胞内微生物的死亡：IFN-a和IFN-13能中和经IFN—Y诱导所增加的H202。IFN．Y还能通过诱导巨噬细胞产生一氧化氮(Nitricoxide，NO)抑制机体的体液免疫应答(Albinaeta1．1991：Kimetal，1996；Estesetal，1998；Benenciaetal，1999：Lowenthaletal，1999：Zhengetal，2000)。IFN-Y是细胞介导的免疫应答中的关键成分，已有证据表明，IFN．Y可能是移植排斥过程中极为重要的分子(Woodetal，1996)。IFN—Y能增强细胞毒T细胞和自然杀伤细胞(Naturalkiller，NK)杀伤靶细胞的能力：能诱导细胞表达IL-2受体，从而促进T细胞增殖，进一步扩大免疫应答(Zhen2，2000)。IFN．Y对抑制性T细胞(SuppressorTcell，Ts)的作用有双向性：通过刺激抗原提呈细胞(AntiEenpresentingcell，APC)诱导Ts产生；但是在迟发型超敏反应和混合淋巴细胞的培养过程中．IFN—y能抑制Ts的产生·IFN-Y抑制Ta2型细胞(HelperTlymphocyte，TH)的增殖并抑制IL-4、IL-10等细胞因子的产生，这种抑制作用能改变免疫反应的类型(细胞免疫或体液免疫)和产生抗体的类型。IFN·y能诱导人B细胞增殖和分化，与IL．2协同增加轻链合成，IFN—Y对B细胞的促增殖作用可能由其他因素介导，因为完全纯化的B细胞对IFN．y无反应。小 鼠B细胞产生19G2。抗体嚣要IFN．Y辅助，而产生lgG3抗体对IFN-Y依赖性较低·IFN-Y能诱导补体c3b受体表达，但抑制该受体与C‰的结台(Finkelman，1988)·tFN—Y投壶下绥藏郭NK缀貔产生。蠲抗蒙或特异性激添裁——魏括援魏斑凝素(Phytohaemagglutinin，PHA)、刀豆索A(ConcanavalinA，ConA)、金黄色葡萄球菌蛋白A(StaphylocoecusptoteinA，SPA)刺激T细胞、IL．2刺激NK细胞均能产生IFN．y(株学颜，t998)。这秘诱导佟麓受顺势调节元辞耱反式谲节佟耀调掩静鞠时，瞧受lFN·Y静反馈调节作用(Heath，1990)。不成熟的IFN．Y鬣白含有信号肽，成熟的IFN·Y因为含有较大的糖基侧链恧分予璧较大，实际上仅寿143个氨基酸残蕊，有的旗至更少。已证甓蒸园工程IFN不禽耱基侧链而仍有活性，所驻曹人认为糖基侧链可能与IFN活性无关，而是参与维持IFN的抗原性与稳定性。生理牧态下，IFN基因受到蛋自搀涮耪静雄锻，阻止蒸毽话蝗麴癌动。在IFN诱生裁兹作糟下，表选一些与基因活性有关的蛋白成分，岛抑制蛋白结合后，使之变成无活性状态，IFN基因的抑制受到解除，转荣生成mRNA，后者在细胞核中合成后，迅速转移至胞浆与核耱侮结舍，魏译或IFN蓠箨，然后壶绩号获指导避入螽囊瓣，经一系≯g貊王、修饰磊簸为成熟的IFN，最后被分泌到细胞外。IFN诱生原理详见图1-1。IFN诱生过程可以分为强个除段：第一输段是诱生剂釉缨魁表鬣受体娟麓终魇，激发～系捌的生纯反应；第二阶段是该生佬厦斑产物作为调控信号启动特定的基因，直接或问接地激活IFN基嚣。促进其表达。现在已经清楚诱生倍号的靶值点在IFN基因上游的IFN殷应元传(Interferonresponseelement，IRE)序列孛。IRE是一静多功熊静增强子痒弼。载IFN．§葡言，IRE包括三个功能区，其中-37～一62为负调控区。．67～-77和．55～-66为两个正调控区(Positiveregulatingdomains，PRDI、11)，其中PRDI包括两个拷贝的重复序列AAGTGAG，分裂与苓弱弱茇残作簿嚣予籀互佟箍。现己静定酶爰式作霜因子有IFN调节因子m1(Interferonregulatoryfactor，IRF)、IRF-2和核因子KB(Nuclearfactor，NF，KB)三种，其中IRF·1和IFN自身可激活的PRDl相互作用，丽NF-xBW激活PRDH，IRF-2可能楚静壹子。当诱导荆生成对。静止状态被解除。在细胞诱生IFN的过程中还有一种叫超诱导(Supednduction)的现象。所谓超诱导就是指细胞在大分子蛋自客成撩利物瓣作用下发生的一秘诱生小势予虽爨矮合或璞热懿瑗象。理在融知有多种大分子柳锖l物或其他物质可以引起IFN的超诱导作用，包括放线菌素D等。采用遮一技术可使人IFN-B的产象增加10～1000倍。关于超诱导现象有如下假说：超诱导作蠲黪本震实鼯上是不豫定戆蛋鑫撩素l现象，当捧鞠勃箨臻予缩齄对。可疆断IFN捧翻蛋鑫mRNA的翻译，可能这一阻抑物在胞质内与抑制氍白mRNA直接作用，使其mRNA翻译活性丧失，此时IFN基嗣大量表达，细臆中IFN积累。1．3鸡干扰素的研究概况自发现IFN以来(Isaacs＆Lindenmann，1957)，臻究者jl雩大类毅崤巍动锄静IFN避蠢了丈量的研究，取得了突破性进展。尽管IFN最筚发现于禽樊，但禽类IFN的研究尤其是分子生物学水平的研究一宜比较滞后(Kohase，1986)。通过熬因和蛋囟水平的劂源性比较及活性分褥等确寇7在禽类建撵存在l型IFN器}l型IFN(Nationalacademypress．1999)。毒 号I言病毒或其他诱生剂★抑制蛋白基因组细胞士◆抑制蛋白mRNA灭活抑制蛋白的特殊因子上．1⋯⋯⋯上抑制蛋台⋯一}干扰素基因去抑制◆十◆不活动性抑制蛋白干扰素基因激活士干扰素mRNA◆干扰素前体+干扰素前体转移到细胞膜+信号肽被切割★成熟干扰素分泌到细胞外图1-1干扰素合成机制示意图Fig．1-1DiagramoftheeompositivemechanismofIFNI．3．1I型鸡干扰素自1994年Sekellick等(1994)首次克隆成功鸡I型IFN基因后至今，鸡IFN分子水平的研究进展非常迅速。seke[1ick通过比较哺乳动物IFN-a，B氨基酸序列，选择保守区域，然后根据该区域的核苷酸序列设计引物，应有逆转录聚合酶链式反应(Reversetranscription．polymerasechainreaction，RT-PCR)技术从病毒诱导的“老化”(Aged)的鸡胚细胞(Chickembryocell)中扩增得到一段长为269bp的片段，然后用它制各探针，以病毒诱导的鸡胚细胞构建cDNA文库，用探针筛选目的克隆，从而得到了鸡类似于哺乳动物的I型IFN基因。在氨基酸水平上，鸡I型IFN与哺乳动物I型IFN序列有20％～24％的同源性，而与哺乳动物II型IFN仅有3％的同源性。编码区(Codingregion)编码31个氨基酸的信号肽和162个氨基酸组成的成熟蛋白，估计成熟蛋白的分子量为19ku。大多数哺乳动物I型IFN具有初级的a螺旋和相似的保守区域。从核苷酸序列推测的鸡I型IFN．预计其蛋白质二级结构与哺乳动物的这种结构是相似的。Northernblot分析和生物学实验研究结果表明，鸡I型IFNmRNA产物与I型IFN诱导产物的特性一致。同时．应用克隆的I型IFNmRNA在鼠细胞 中的表达，得到具有生物学活性的鸡I型IFN蛋白质，该蛋白质可被纯化得到的鸡IFN单克隆抗体所中和(SchuItz，1995)。近年来的研究表明，鸡I型IFN基因类似于哺乳动物I型IFN，同样没有内含子，其基因数量较多．且至少编码两类血清型明显不同的、具有抗病毒活性的IFN蛋白质(Sick，1994)。Schults将病毒诱导的鸡I型IFNcDNA克隆在COS-7和大肠杆菌(Escheriehiacoli．E．Coli)中表达，得到的重组鸡I型IFN具有强烈的抗病毒活性．但不能诱导鸡原代单核细胞来源的巨噬细胞分泌NO，即这种重组鸡1型IFN缺乏MAF活性(Schults．1995)。抗重组鸡I型IFN的抗血清可封闭天然鸡1FN的大部分抗病毒活性，但不能封闭MAF活性，而且发现天然鸡IFN的MAF活性对蛋白酶高度敏感。这些结果和其他一些研究(Lillehoj，1992)表明鸡的淋巴细胞受到有丝分裂原刺激后可能分泌另一种类型的IFN，即鸡也存在IFN-Y。这些现象促使许多学者致力于鸡IFN·Y的探索和深入研究。1-3．2II型鸡干扰素Lowenthal等(1995)从有丝分裂原刺激的鸡脾淋巴细胞中得到了对热、pH2敏感的IFN，它能激活巨噬细胞产生NO，这与哺乳动物IFN．Y相似，从而证明鸡体内同样存在IFN．y(Chiekeninterferon．Y，ChlFN．Y)。之后，Digby和Song等(1995)先后采用RT-PCR方法从高效诱导的T细胞系(CC8．1h)和CD4+T细胞杂交瘤中扩增得到了鸡IFN．Y基因，其完整的阅读框为492个碱基。推测成熟蛋白为145个氨基酸，分子量为16．8ku。与马和人氨基酸序列的同源性分别为35％和32％，且有一些高度保守的序列，如C末端的KRKR序列，而与I型IFN的同源性仅为15％。因此根据核苷酸和氨基酸序列的变异，可以推算出IFN基因的进化过程。据估计单拷贝DNA的变异率为O．10／d百万年，所以推断，两种主要类型1FN(I型IFN和II型IFN)的出现要旱于发生在3．5亿年以前的鸡和哺乳动物的分化。Kaiser等于1998年对鸡IFN—Y基因组结构进行了研究，从基因组DNA克隆得到了鸡1FN．Y基因的全序列，并与哺乳动物基因组DNA进行了比较，证明其结构与哺乳动物的非常相似(Kaiser．1998)。从而表明鸡IF／,／．Y也是一个单拷贝基因，是由4个外显子和3个内含子组成，每个外显子编码的氨基酸数量与哺乳动物相当，但仅第二个外显子与哺乳动物的同源性较高，为72％。第1个外显子包括5’端的非编码区(5’．terminaluntranslatedregion。5’一UTR)，编码19个氨基酸的信号肽和成熟蛋白的前22个氨基酸，第2．4个外显子分别编码23，60和40个氨基酸，第4个外显子包含终止子和3’-UTR。在3个内含子中，前两个长于哺乳动物，而第3个显著短于哺乳动物，见图1．2。Kaiser等(1998)根据鸡IFN-Y设计多个引物，得到了鸟形目中的日本鹌鹑、火鸡、珍珠鸡和雉的IFN—Y基因全序列。序列分析表明，禽类IFN．Y基因编码区在所研究的禽类中是高度保守的，核酸和氨基酸水平的同源性分别为93．5％～96．7％和87．8％～97．6％。氨基端(外显子l和外显子2)比羧基端(外显子3和外显子4)更保守。从所推测的氨基酸序列间的高度保守性及IFN-Y受体结合基元(Motif)的同一性来看，这些禽类的IFN．Y之间可能存在交叉反应。鸭IFN-Y基因也已被克隆，基因长度与其他禽类IFN．Y基因长度一致．与鸡和哺乳动物IFN—Y氨基酸的同源性分别为67％和21％～34％。通过基因进化树可以看出，各种动物IFN。6 Y序列的同源性与推测的进化关系是一致的。38I238kb2I6I242kb44人371147kb23612．800kb45猪Pig37I159kb23611．32kb45马￡卜—乎E于——曰卜一№。。371150kb23612150kb35大鼠381,237kb23612,436kb45旱獭Marmoset4lI825kb2360641bp40鸡￡-_珈_E|—曰卜—～c眦胁—_非翻译区(Untranslated)[]翻译区(1’ranslafed)图1-2哺乳动物和鸡ⅢN．Y基因结构比较Figl‘2ComparisionofthegenestructureofchickenIFN．Ywiththoseofitsmammalianhomoiogues．1．3-3鸡干扰素激活蛋白I型和II里1IFN均能结合于特异的细胞表面受体上，诱导几个细胞蛋白的转录，从而激活一个直接通向核内的信号途径。这种转录调控作用是通过位于IFN可诱导基因(IFN—induciblegenes)5’端上游的增强元件(Enhancerelement)介导的。在哺乳动物细胞中，7 东北农业大学农学硕士学位论文已发现与a／B．IFN相关的两类增强元件：IFN刺激的反应元件(IFN．stimulatedresponseelement，ISRE)和IFN共有序列(InterferonCONSENSUSsequence，ItS)。虽然鸡和哺乳动物f黧|FK之闼的目漂馁并不裹，毽二者瘀动子彦到具有诲多楣经性，这表臻=者IFN诱导懿基因转录具材相似的途径。研究还发现，鹏IFN诱导产生的Mx蛋白5’端上游区存在一个ISRE样序列。根据报道，鹏I型IFN基因5’端上游区包含一个姆哺乳动物ICS基序相似的基序，蔼鼠鸡的ICS基序的硫可谖猁l壅IFN。研究表鹤。雳一个或多个拷获的鸡ICS序弼斡质粒转染鸡胚成纤维细胞(Chickembryofibroblast，CEF)，可增强IFN刺激的氯穰素乙酰转移酶(Chloramphenicolacetyltmnsferase，CAT)活性，嚣显在CAT缺乏对这种活性明显降低。IFN作糟原理觅豳1．3。同种干扰素lV靶细胞膜受体识剐(种属特异性)0TK激漭I，ISGF-3n的三个亚基分别磷酸他后与一瓣DNA结台蛋白共嗣形成题浆薅0四聚体入核井激活ISG上游的ISRE◆ISGmRNAs◆撬病毒蛋爨(无晕申溪特异馁)0◆·一⋯ATP⋯—◆◆●—'幛解2-5A。2-5AdsRNA．elF2Ⅱ磷酸化去除tRNA的pCpCA末端÷◆毒煎墅塑．查墼壁墼塑鐾堕垫燕!塑堡鬻l-3予撬素穆翔簇堙示意蓬Figl·3DiagramoftheactivatedmechanismoflFN一蝴一微燃一埔％壤麟阱麟一一一一～一一一一一一一解一裘一嗍～一一一一一一。～一一一黼一番{：。受礞是睬僦肮麒撇性黼黼辨僦鼬舯麟丈豫家导乳矮威个接哺激馘酚嫩啉熬 活。第一个IFN．Y活化序列(Interferongammaactivatingsequence，GAS)位点发现于鸟苷酸结合蛋白(Guanylate-bindingprotein，GBP)的上游。Schwemmle等(1996)克隆了一个鸡GBP基因，发现其与哺乳动物GBP的序列具有明显的相似性。这表明IFN-y-转录激活途径在鸡和哺乳动物中可能是保守的。最近发现鸡存在几个GAS样基因，但目前仍无足够的证据表明鸡也存在这种调节途径(Schwemmleetal，1996)·1．4干扰素用于治疗与预防疾病的潜力肉用畜禽在养殖过程中常会感染致病菌，从而使养殖业蒙受巨大损失。当前所采取的措施是应用疫苗或抗生素使动物免受疾病的侵袭。但是，疫苗只能针对特定瘸原产生长期的保护，在动物没有明显症状时，应用广谱抗生素仅可在短期内使动物免受致病菌的侵袭。事实上．世界上有一半的抗生素用于农业。然而遗憾的是，由于过度使用广谱抗生素。尤其是与人类应用相同的抗生索，极易引起细菌的耐药性．而且抗生素可残留在肉制品中，通过食物链直接影响到人类的健康，该问题已引起广泛关注。世界卫生组织(TheWorldHealthOrganisation，WHO)已开始建议停止在肉制品中使用与人用抗生素相同或有交叉反应的抗生素。同时，他们呼吁应用环境友好(environmentally．friendly)的方法来控制疾病(Lowenthaleta1．1999)。目前，全世界每年大约需要消耗400亿只肉鸡，所消耗的鸡肉量约占全部肉制品总量的40％，为提供健康的鸡肉，每年要耗费几十亿美元用于饲养和防疫。雏鸡在出生2周内由于免疫系统不成熟，母源抗体含量逐渐下降以及由于饲养不当而造成其感染条件致病菌，这样会造成雏鸡生长缓慢、体重下降，甚至死亡，这在养禽业是一重大损失。鸡的免疫系统以及在病原感染或注射疫苗时所产生的免疫反应与哺乳动物相似，所以考虑应用细胞因子来控制疾病。相对来说，禽类的饲养简单、廉价、出笼时间短、而且数量较大．这就需要考虑所用疫苗的经济价值。所以，葬禽业迫切需要新一代天然治疗方法。在病原感染和疫苗免疫中，细胞因子可调控免疫反应的类型与程度，是一种高效、天然的治疗方法。其治疗效果在人和动物身上已有论证(Murtaughetal，1996：Heathetal，1992：Nohriaetal，1994)。已有研究证明，(1)首次免疫时将抗原与鸡IFN．Y联合应用，可促进第二次免疫时的抗体反应并延长抗体持续时间；(2)与鸡IFN—Y同时接种可使低浓度抗原被充分利用，提高疫苗的免疫效果：鸡IFlq—Y与抗原联合使用可在群体中诱导产生均一的免疫反应；(4)鸡IFN-y与抗原联合使用，可使鸡的感染率下降，在感染过程中，实验鸡的体重下降速度显著低于不加IFN·y的对照组，同时，在恢复过程中，实验组鸡的体重增加速度高于对照组。以上这些特点都是IFN．Y作为疫苗佐剂的理论依据(Songetal，1997：Lowenthalctal，1998；Hung-yuehetal，1999)。生物技术的应用不但可使重组IFN．Y蛋白的研制达到规模化生产的目的。而且使得IFN-Y基因在体外具有可操作性。尤其是将靶抗原基因与IFN．Y基因构建共表达(Co-express)质粒作为基因疫苗来应用或者将IFN．y基因和靶抗原基因构建病毒活载体疫苗，根据病毒载体的特性，有目的地将IFN．y和靶基因编码的蛋白定向导入机体特定部位以获得预期的免疫效果(Leongetal，1994)。对于鸡IFN．Y来说，有些方面的研究虽然取得了较快的进展，但很多方面的研究才刚刚起步，全面了解鸡IFN．Y蛋白的生物学功能及其在免疫反应中的特点，并在其抵抗疫病中作为免疫增强剂的应用研究以及作为9 东魏表披穴学表学硪士学谴论文研究模型在比较免疫学中均具有重要意义。目前已经证明程大肠杆菌中表达的鸡重组IFN·Y蛋嶷活洼与天然鸡IFN-￥摆钕，嚣群暴窍抗瘾毒鞠免疫{霹麓作蠲(Lowenthal畦al，1998)，而殿重组鸡IFN．Y其有佐剂效应(Schijnsetal，2000)。同时发现鸡IFN-Y与新城疫病毒(Helleretal，1997)、马立克氏病毒(Volpinietal，1996：Levyetal，1999；Xingetal，2000)、汐f1氏萤(Guligetal，1997：Baoetal·2000：Famclletal，2001)、艾美尔球虫(Patriciaetal，1997；Dimieretal，1998：Lillehojetal，1998：Dimieretal，1999：Rothwelletal，2000：Yunetal，2000)等撬原联台应躅，可以据毫鸡纲脆免疫的农乎。与嚣终疆究魄较，藿瞧对鸡IFN，Y的研究起步较魄，包括IFN-Y在内的鸡细胞因子的研究相对落后，缺点重组鸡IFN．Y鬣白及兔抗鸡1FN吖蛋白的多克隆或单克隆抗体等基础研究试剂，不但是造成相关研究滞鑫麓主要蒙鞭，磊虽奄是疆壹避一步遴移深入研究魏重要觳素。这巍是本礤究意Y．2_N在。0 材料与方法2材料与方法2．1材料2．1。l嶷验动物5周龄SPF雏鸡，由哈尔滨兽暖研究所密验动物中心提供。2月龄新蓖兰健康白兔，由哈尔滨兽医研究所实骏动物中心提供。2．1．2膜粒和受体菌pUCl9质粒、犬瑟抒麓(Escherichiacoli，E．coli)DH5d受体赫、表达载体pPROEXrUHT为哈尔滨兽医研究所羹物技术藏傈存。2．1．3工具酶及试剂M-MOV反转录酶、RNasin、TaqDNA聚合酶、限制性内切酶、GIBCO产品；Klenow酶、T4DNA酶，为GIBCO产品：DNA回收试剂盒，北京鼎国生物技术公司产晶；DNA连接酶，德国宝灵黧公司产箍：HisTaq露APWesternRegents试帮盒，Novagen公司产品：ProBond⋯Resin骚白质纯化层析挂，Invitrogen公司产品。碱裂解法提取质粒所髑主要试瓤、培葬纂及电泳缓冲滚：溶液h50mmol／L葡萄糖、25mmol／LTris·C1(pH8．O)、10mmol／LEDTA，10磷黼压灭蔫15min，贮存于4℃。漆液{{：O。2mol／LNaOH，1％SDS，耀裁铁2mol／LNaOH和10％SDS耩释配置。溶液HI：5mol几己酸钾60ml、冰己酸11．5ml、H，O28．5ml。LB培养基：在950mlddH20中加入细菌培养用胰化蛋臼胨(baeto-tryptone)109、细菌培葬拜l酵母撼敬魏(baeto-yeastextract)59、NaCttog，摇动容器直至溶菝完全溶解，蠲5mot／LNaOH调节PH至7．0，加入ddH20至1L，15磅高雁蒸汽灭菌20rain。SOC培养基：在950mlddH20中加入细菌培养用胰化缓自蕊(bacto-tryptone)209、细菌培养用酵蹲提取物(bacto·yeastextract)59、NaCIO．59，摇动容器赢至溶旗完全溶貅，然后加入250mmol／LKCI溶液10ml，用5mol／LNaOH调节PH至7．0，加入ddH20至1L，15磅高压蒸汽灭蔻20min。TE(pH8．0)：10mmol／LTris·HCl(prig．O)，Immol／LEDTA(pH8．0)。Tris*乙酸(TAE)屯泳缓冲液按常规方法配制(金冬雁，1992)。1×菠震波：0．04moPLTris+乙酸、0。00tmol／LEDTA。50×贮存液：2429Tris碱、57．1ml冰乙酸、100ml0．5molFLEDTA(pH8．0)。2。1．4孳|物根据Digby等(1995)报告的序列，在基因上下游分别设计PI和P2引物，由裳生物工耀(大连)公司金成。 东北农业太学农学硕士学位论文_IIIII—II———————————————III一,II．．．．．．IIIIll[1111111111z#!_ePl!S’。尊矗GAC粥CCAGAC鞠除e4’P2：5"-T1AGCAArrGCATCTCCA一3’2+1．5皇要饺嚣PCR扩增仪(GeneAmpPCRSystem2400)，PERKIN-ELMER公司产品；藏邃冷猿离心规(J2-21M)，曩强Beckman公蜀产菇；台式离心撬(202MK)，荑黧Beckman公阕产菇：低温台式高速离心枫，德围BECKMANMiegr∥M2l艮．70℃超艇滋球藉，Revco公司产晶；．20。C冷冻冰柜和4"C冷藏冰箱，海尔公司产晶；微波炉，鐾本松下公霹产茹；紫井势必凫度诗。葵莓Pbarmaeia公蔼，Ultrospec3000垄；瓿流电泳仪，DYY—m型。北京六一仪器厂；电渌稽，麓豪襄方赫力辩赘中心；蕊壹扳魄竦系绞，BIO--RADMV{2e型，SanBatInstru§ments￡》{c；空气浴掇荡器(HZQ-C)，哈尔演东联电予有限公司；蠖溢忒涤籍(22t9)，璃热BROMMA公霹产晶；魄热懂澈水稽(DK-8D)，上海精宏蜜验设备脊壤公回；紫，}灯(DJZ)，上海颞埘彀悲纹器厂：凝菠成豫系统(ImageMasterVDS)，璃典Pharmaeia公鼋产箍{C02恒温培养箱，Verco公司：离予拳垒娥饺，醴零Miltipore公嚣：铡球抵，SANY0公司；趟声粉碎仪，美国ARTEK公司产SONICDISMEMBRATORMODEL301型{其它靛器，蠢饕嚣燕魏袭拳霪家耋《实验室鬻翅坟黎。2．2方法2．2．1璃簿缨耱的培养疑总RNA魏攥教2．2，1．1鸡牌淋巴细胞的分黼笼蓥毅键瘫5蠲龄鸡薪鲜赫整骛箨燕予冷耱Hank's液孛，在经DEPC薤骥熬磅舞爨孛臻醉，4009离心Stain除去红蠲臌，小心墩取含糍纂个簿缨鹣触上鼷液，慝Hank's液稀释最氍10009离心5min收寨淋巴细胞一以Hank’s液洗涤淋巴细胞2次，再以RPMI1640培弊液洗涤1次，并撩释或每糍爵含2Xl妒个霸鼹静攀缨藏悉渡。2．2．1．2璃麟游巴绥鹣魏诱蒜培养⋯。取单塑胞息液，篷后加入终浓度为30Itg／ml的ConA，鬣于s％cch、39．g。C条传下诱导嚣垡48。鼍雹：．!望墼i堕5raint弃去上游，蠲DEPC整理承悬浮沉淀+按每t00ul襻鼹孛禽1、6x10。个镝熊撵取缡臌总RNA。⋯‘一2．2。1．3缁胞总RNA的提取攘Promega公霹鹩RNAgentsTotalRNAIsolmionSystem试裁窳淡弱襄避嚣操搏。耀灭{2 $-'J：FI"--’．Ofz；H7．0)PBS薯黜船⋯溶液，名黼鐾黯蒜嚣娑蒜瞽鬻畏。狮嚣箱翕熬·戮嚣1。勰。霉麓，室温2000鬻g船：on，秉墓器量茎瓣。1罂芏篓湍2翼篱’卜裁僦蠹c4涨1lh。于4静"C篙512训00“09蔷崭15取慧蒜嬲冕倍以上体积的异丙醇在-200沉淀·于以离心mln，．井理上猾·冉用Ⅲ％的乙醇洗一遍，弃掉上清，离心管倒置在吸水纸上。最后将沉淀后的核酸溶t27p，1．粤91处理过的水中。取2pl稀释100倍后在紫外分光光度仪上测定其OD260，OD2so比值，该值：在所取cDNAluL，ddH，O10×buffer然后依次加入37．5ul5．0UIdNTPPl4．Ou1．0ⅡP21．0ulTaqDNA聚合酶0．5uI混匀后进行PCR扩增。循环参数为：95℃5rain：94"(2lmin，50"Clmin，72"C1rain，30个循环：最后72"C延伸7rain。扩增结束后，取5ul混合物于1％琼脂糖凝胶中电泳20min。2．2．3鸡IFN-Y基因的克隆2．2．3．1PCR产物的补平与连接取PCR产物100ul，用Klenow酶补平末端，1％低熔点琼脂糖凝胶电泳回收目的片段，按北京鼎国生物技术公司胶回收试剂盒说明书操作。用洁净的刀片在长波紫外灯下切取含有目的基因的琼脂糖胶块，放入1．5ml离心管中。按每lOOmg琼脂糖胶加入450u1溶液B，置55℃水浴10rain，每2rain颠倒混匀一次，使琼脂糖胶块完全溶化。将溶化后的琼脂糖胶移入离心柱，室温下静置2min，80009离心lmin，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放回收集管中。在吸附柱中加入450pl溶液C，80009离心lmin，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放回收集管中。重复上一步骤一次。150009离心lmin，以甩干剩余液体。将吸附柱放入新的1．5ml离心管中，在吸附膜的中央加入55℃预热的溶液D30Hl。55℃水浴静置3～4min后，室温下120009离心lmin。弃去吸附柱，将存于管底的DNA贮存于．20℃备用。取311l回收产物悬于12“lddH20中。加入酶切处理的pUCl9质粒lul及1"4DNA连接酶和buffer各2ul，16℃水浴，连接12h。2．2．3．2大肠杆菌感受态细胞的制备从于37℃下培养16～20h的新鲜平板中挑取一个DH5a的单个菌落，转移到一个含有100mlLB培养基的lL烧瓶中。于37"C剧烈震荡培养约3h。每隔30min溯ODc,oo值来监测培养物的生长情况。在无菌条件下将细菌转移到一次性灭菌、用冰预冷的50ml聚丙烯管中。在冰上放置10min，使培养物冷却至0℃。于4"t2以40009离心10min．以回收细胞。倒出培养液，将管倒置1rain以使最后残留痕量培养液流尽。以10ml用冰预冷的O．1mol／LCaCl2重悬沉淀，放置于冰浴上。于4"12以40009离心10min。以回收细胞。倒出培养液，将管倒置Imin以使最后残留痕量培养液流尽。每50ml初始培养物用2ml用冰预冷的O．Imol／LCaCl2重悬细 胞沉淀。分装于Eppendoff管中，于一70"(2保存·2．2．3．3连接产物的转1七将连有鸡IFN—Y基因的pUC．19阳性质粒加入E．coliDH5n感受态细胞，混匀，冰浴30min，将离心管转移到42"C水浴90sec。将离心管迅速转移到冰浴中。使细胞冷却1-2min·每管加800ul37"C预热的SOC培养基，轻轻混匀。37"(2震荡培养lh。3009离心4min，弃去大部分上清．重悬沉淀，涂布于Amp+(浓度为100mg／m1)LB琼脂培养基上。倒置平板，37"C培养过夜。挑取单个菌落在含Amp+(浓度为100mg／m1)的LB培养基中于37"(2振荡培养8h，碱裂解法提取质粒。2．2．3．4质粒的小量提取按照碱裂解法进行(金冬雁等，1992)。将离心所得细菌沉淀重悬于100ul用冰预冷的溶液1中，剧烈震荡。加200ul新配制的溶液II。盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内容物。应确保离心管的整个内表面均与溶液II接触。将离心管放置于冰上。加150uI用冰预冷的溶液ⅡI。盖紧管口，将管倒置后温和地震荡10sec使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上3～5min。用微量离心机于4℃以110009离心5rain，将上清转移到另一离心管中。加等量酚：氯仿，震荡混匀，用微量离心机于4"C以l10009离心5rain，将上清转移到另一离心管中。用2倍体积的乙醇沉淀DNA，震荡混合，于4"C放置15rain。用微量离心机于4"C以130009离心5min。小心吸去上清液，将离心管倒置于一张吸水纸上，以使所有的液体流出。再将附于管壁的液滴除去。在空气中使核酸沉淀干燥10rain。用50“l含无DNA酶的胰RNA酶(20pg／m1)的TE重新溶解核酸。贮存于．20℃。2．2．4克隆鉴定及序列测定取4ul质粒，加ddH2012ul、再加限制性内切酶EcoRI、HindHI各1ul、10Xbufier211l，于37℃水浴消化30min以上，取部分酶切产物及质粒PCR筛选的重组阳性克隆于l％琼脂糖凝胶上电泳20rain。另取一部分样品由宝生物工程(大连)公司进行双链序列分析。2．2．5鸡lFN-Y基因表达载体的构建与测序2．2．5．1原核表达载体的构建用PstI和KpnI双酶切(所用酶总量不超过体系1／10)分别处理原核表达载体pPROEX⋯HT和连有鸡IFN-Y基因的pUC-19阳性质粒，37℃水浴作用1h。1％琼脂糖凝胶电泳分别回收载体及鸡IFN·Y基因，按北京鼎国生物技术公司胶回收试剂盒说明书操作，方法同2．2．3．1。取回收得到的鸡IFN·Y基因10ul、载体的回收产物6Ⅱl，加入10Xbufier及DNA连接酶各2ul，14"C水浴连接12h。将所得阳性重组质粒pPROEXTMHT-IFN．y转化到大肠杆菌DH5o感受态细胞中，冰浴30min．42"C水浴90sec，冰浴冷却1-2min，转移至37℃预热的SOC培养基，于37"Cf荡培养lh。3009离心4rain。弃去上清，重悬沉淀．涂布于Amp+(60ug／m1)LB琼脂培养基上·倒置平板37℃培养10h。筛选阳性菌落，碱裂解法提取质粒。按常规方法操作(金冬雁，1992)，方法同2．2．3A。2．2．5．2鸡IFN—y基因的鉴定及序列测定取所得质粒5uI、10×buffer2ul、EcoRI、HindⅢ各1u1、ddH2011p】，37"C7k浴14 一I．⋯IIIIIIIII查I童童耋娄茎窑茎鎏耋学往鹜⋯I"llll'l—l!!!．。。．———．．．．。———．———————————————————————一==OD，‰。值不辩增长时以50009离心5min收获菌体沉淀，。将细菌沉淀用37℃预热的6M盐酸瓤藏}解缓羚滚(6M簸酸薮；20ramt',la3P04pH7．蓉t500ramNaCD燕嘉i灌瓣，转入三旁l瓶中在磁力搅拌器上缓慢搅拌30rain。超声波裂解5～7次，每次大约5sec，于4"C·30009离心15min，收集上清波。将上清渡加入事先用14mlpH7．8的变性结会液(SM尿素；20raMNa3P04pH7．8：500raMNaCI)平衡过静骚自质纯化层析较中，以下撩熊ProBondTMResin蛋白纯化试剂盎说明书方法进行骚自质的纯化。用pH7．8的变性结合液每次4ml。缓慢过拄。洗2次。用PH6+0鲍交蛙洗渡(8磁尿素；20raMNa3P04pH7．s；500ramNaCl)每次4ml，缓悭过柱，洗2次。用PH5．3的囊性洗液(SM尿素；20raMNaHP04pH7．8；500mMNaCI)每次4ml，缓慢过柱，洗2次。用PH4．0的燮性洗脱液(8M尿素；20mMNa3P04pH7．8；500mMNaCI)每次6ml，缓懂涟拄，洗2次，纯讫产耱牧集裂离心骛中。取筑纯产耪热入等体积黔2XSDS凝胶上样缓冲液，煮沸5min，冰浴2min。处理完后．进行SDS-PAGE凝胶电泳观察纯化效果。2．2．7融合蛋白的免疫原性研究2，2．7．1多克潦抗盘港懿割簧将诱导表逸融合蛋幽的样品lml(约奢目的蛋自100ug)按2．2．6．1样品处璁的方法进行处理，将样品用12％的SDS．PAGE凝胶电泳分离后，用冰预冷的KCI染色液染饿20rain，准确切下含毒嚣瓣蛋白豹凝获条带，魏入lml弗氏竞全佐裁、lmlPBS骈磨翻戒涌巍翔蕾，对2月龄健康新谢兰白兔厝肢肌肉分多点注射免疫。曾免后20d和30d分别用纯化厢的Iml(含目的强自50ug)、o．5ml融合虽是(含尉盼蛋自25Hg)进行第二次秘第三次加强免疫，第三次免疫后第10d经心脏采盘憝筏兔。按常规方法制备撬斑清。2．2．7．2多克隆抗体的艇定将制备的兔抗鸡IFN-y多克憝抗体按1：5、1：25、1：50、h100秘1：200熬耩释度势爨耩释，轻正常兔飙清为对照，与1：10稀释韵纯化鸡IFN-Y重组蛋白按常规方法进行琼脂扩散实验。16 ，。。。。。，。。。，耋当。，』二，。。。，。。。。，，。，，me。，，——s==e!—一3结果3．1鸡IFN一￥cDNA麴PCR鉴定I％变一mHl脂柑跚歧IU泳姒1；，PCR抄J*广：物¨段K度约490bp(㈨3-I鹅I泳通)·与翻的基刚的分于靛人小一致，对照矧没有扩增出基带(黝3-I楚2泳道)。瑚拢初步确定鸡IFN—YeDNAU兜隧剑pUCl9l：。吐矧3一l。IPCR扩坤}，“物2川‘rI：剐J!H3Marker})￡，．2001}LaneII’CRploductsLane2ControlgroupLane3MarkerDL-2000罔3—1鸡IFN—yeDNA的PCR鉴定Fi筘一IThePCRidentificationofc|lieken1FN—YeDNA3．2重组阳性膜粒pUC19-chlFN—v的鉴定小髓制薪质靴，经限制忭内【卿舞EcoRI+Hind11l舣酶鼢及PCR扩埔。O+8％琼脂耥凝股lLl泳移永。PCR4rj曾j“：物¨段K嫂约490bp(㈧3-3第5确I第6泳逆)，jJr{的毖矧势严驳夫小”馥。磺瓣秘缝聚疆示，强瓣条带存掰条，一条约490bp，与鸡IVN。￥cDNA人小。致，粥‘条人小约21kb，‘jpUCt9分r球：人小一致，表明鸡IFN．YeDNA11：确插入pUCl9的⋯均协出(矧3-3撼3、4泳逆)。埂纠蛾粒测j≯结聚嗣梯发明将编弼IFN．Y赞n耩lAllli确地捕入到pUCl9的il的他点。j}粥弛洚l3-2、3-3。矗蠢嚣AC’l’’11G(二CA(：；Ae7}、‘11ACAAC瓣奄7l。{”}G’}11、C’l毪。le，|G+f℃Afl℃N弘GAf’}’妊镰’’l’Af‘GGAC／¨1ACT(jCAAGTC1、AAATC1TGT下CAACT'11CAAGATGAT／¨’AGACAAACTGAAAGCTGACT'F11AAC’FCAAGTCAT’FCAGATGTAGCTGACGGTGGACCT膏r11A1、1’G’l℃AGAGAAAC’11GAAGAACTGG．△￡盎GAGAGAAATGAGAAAAGGA1’CA‘lACTGAGCCAGATTGTT11CGAhrG1AC1'11GGAAATGCTTGAAAACACTGACAAGTCAAAGCCGCACA，i、CAAACACATA{℃+rGAGG盎GCl’e’l肖fACTC’怒7 。。。。叠量呈坌基翟筌坌冀墓耋兰垒翟未。，，。。，，。—eses—essAAAAACCTTCCTGKFGGCGTGAAGGTGAAAGATATCATGGACCTGGCCAAGCTCCCGAhI’GAACGAC，11TGAGAATCCAGCGCAAAGCCGCGAM、GAACTCl了eAGCATCT张CAGAAGCTGGTGGATCCTCCGAGTT下eAAAAGGAAAAGGAGCCAGTC’rCAGAGGAGATGCAATTGCTAA圈3-2鸡IFN—Y基嚣序列，鞠影部分为起始密码予，下划线部分为潜在的糖基化做点Fig3-2Chickeninterferon—Ygenesequence。ThepartwithblackbackgmundwasthestartcodonandtwopotentialN-linkedglycosylationsiteswereunderlined-1MarkerDL-150002MarkerDL-20003和4pUC{9-chlFN—y的EeoRI、HindIII戳酶切鉴定5秘6pUCl9-ehlFN一￥瓣PCR鍪定Lane1Markel'DL．15000Lane2Markel'DL-2000Lane3andLane4EcoR{÷HindliiDigestionofpUCl9-chlFN-vLane5andLane6聪RAmplifiedofpUCl9-chlFN—Y闰3-3pUCl9一ehlFN-Y的取酶切及PCR鉴定Fig3-3IdentificationofrecombinantchickenIFN一￥cDNAbyPCRanddigestedwithEcoRl+HindI珏(doubleRE)．3．3熏组质粒pPROEXTMHT。IFN．Y的签定枣量裁籀鞠旗鞍，经&t{矧Kpni疑酶切及PCR扩增。{％琼￡i糖凝胶电泳显示，PCR扩增产物片段K=度约490bp(图3-5第3泳道)，与tq的熬冈分子爝大小一致。袱酶切结巢显示，目蜘条沓存涎条，一条约490bp，与鸡tFN，ycDNA大小一致，曼一条夫予4．5kb，与表达载体分子量(4．7kb)火小一致，表明鸡tFN．YcDNA正确插入表达载体的目的位18 点(豫3-5掩2源道)。重缀蔟辍谢痔缩架袭暌褥编码WN．Y基丽^E确施撬入翻琢禳表达载体n{J11ff{)他点。分圳见图3-4、3-5。A，rGAC’l'，f0CCAGAC’r7lACAACrrG’r1_TGT．rCTGTC4FG，f+CA，rCA丁GA，rrrMICO’rYNLFVLSVlMI了蜀f1A羊GGAeA-fAC羊GeAAGl’AG彳C+淞A，镰、e下Ta}下CAAC1‘TCAA8A羊YGHTASLNLVOLODGⅣ11A‘1’AGACAAAC1YOAAAGC-I’GACTTTAAC’I℃AAGTCATTCAGATG1’ADlDl<0KADFNSHSDVGCTGACGG‘rGGACCTATTⅣl’TGTAGAGAAACTGAAGAACTGGACAGAGADGPlIV8KLKNW1’8△G^AA．1、GAGAAAAGGA．f1C^1IACTG^GCCAG^1”rGTT1℃GA下G1’^C1’TGRNBKRILS0IVSMYLGAAATGCTTGAAAACAC下GACAAO’rCAAAGCCGCAC声泣CAAAeAC≯矗IAEMl。ENTDKSKPHIKlllTCTaAGGAGCTCTATACTCTGAAAAACCTTCCTG—汀GGCGTGAAGS￡ELV下LKNLPDGVKAAGGTGAAAG矾蝌c矾GGACCq”GGCCAAGCTCCCGATGAACGAC’FTGKVKDIMDLAKLPMNDLAGA硝℃CAGCGCAAAGCCGCGA耵GAACW’F代AGCA下C甲愀CAGAAGRIQRKANELFSILOKCTGG’l书GATCC’l、CC(；AG’FTTCAAAAGGAAAAGGAGCCAGTC’rCAGAGGLVDPSFKRKRSQSORAGATGCA／u1TGCllAA袋CKC阔3-4鸡IFN—y基因序列及其所摊导的氨熬艘序列爨影罄势必起始密玛予，下裂线部分势澎在蕊壤基诬鼓杰Fig3-4GenesequenceandthededuceaminoacidsequenceofChickeninterferon．YThepartwithblackbackgroundWasthestartcodonandtwopotentialN-linkedglycosylafionsiteswereundedined。9 tMarkerx-IlhidlIldigest2Pstl最}KpnI藏酶礁3PCR扩增Lane1Marker^-IlindmdigestLane2Psil十Kpnl||ldigestLane3PC疑Products燃3．5妪+It鸡IFN*Y基因联酶辫殿PCR慧定Fig3-5Identificationofreeombinartteh靶ken|FN-￥eDNAbyPCRanddigestedwith鹣tl黍lKpnl(doubleRE)．3．4羹缓璃IFN．￥器壹的表达秘鉴定褥pPROEX⋯}|，0IFN。y-转绝大强搴1‘赫DH5ct受{率辩，援不渊麴舞导浆裁、送行港鼯，经SDS+PAGE凝骏电泳发蠛诱导蘩{{零=褒分二于聚终22ku照搬理了⋯象蛋是露，与穰翅太小制椅(剐3-6第1～4溶遴稿}第6～10淋道)。将诱导袭立是厩的麓休总受内经SDS。PAGE}U泳瓣转移举硝酸纾维骥，艇蜊挠6×His的}fis’iag静APWesternRegems试触嶷邋行Westel#blot箍定，程群}藩舞弘_济楚j{{}蕊察铡⋯条囊矗渗，与SDS．PAGE凝羧fn潦lt|j；．1l糯曲螯啦火小一致(蹦3-6鳃ll,Ill第i2溶遂)。袭嚷滚疆趣在大躲{}：藏中耱褥了表达。镰离子亲莉l挺鼗螗化∞砸组擞翔羟SDS．PAGE电溶J|纛也发现了b凑母表达，“耨努予蘩一致瀚,lll：Jt'．s．。篼隅3-6。3．5重组璃IFN．Y蘩白裘这量瓣确定慧艨获发耋I濑分耩测褥势予最为22ku蜘鸡。1FN￥氆趣魏l’i魏体总蛋l：}趣33％。楚翻3。7。3,6免疫艨J}生研褒抗鸡l潮一￥缓爨多兜臻凌毒拳0鬃羹{挽辍溺爱寝疆趱蓠玫灸疫爨{第三次受浚瓣撬魏消‘i纯化的抗原进{}琼脂女。敬实验，摭原作l：lo稀释，发现首次免疫抗酝汝的反斑滚皮为I：5，第二三次免痰挽l＆清绱覆癍滴波为1：25。it!；g％ilti溃与缝纯的鹈IFN。￥蠢匀无蜃癍}|：。梵矧3-8。 ～4经IPIIG诱铮历，曲休&j厶缬5低分子最蛋白Matker6朱经lP’FG诱导f10lgl’|!_|：剥j!{{7～10经旷IG诱导历．汹体表达蛋r1l～12经镍离子亲和树脂纯化的重组蛋白LaoeI～4ExplessedI’roleinbyIP’1’GlnducedIJane5I，OWMoleculalWeightProteinMarkerLane6C011IrolGI_OtlPLalle7一一10ExpressedI’roleinbyII’T(]Incluced1。alleI1～12PuriedReconlbhlanCProteinhvNickleResin图3-6鸡IFN．Y蛋白SDS．PAGE凝胶电泳分析结果Fi93．6SDS．PAGEanalysisofchickenIFN．y图3—7鸡1FN．Y的Western转印结果Fi93—7ThewestenblotofchickenIFN—Y2 1按12按l3按14按I5按15倍稀释n勺兔抗鸡IFN—Y多兜隆抗体25倍稀释n0兔抗鸡IFN．y多克隆抗体50倍稀释的兔抗鸡IFN．Y多克隆抗体100倍稀释的兔抗鸡IFN．y多克隆抗体200俯稀释的兔抗鸡IFN．y多克隆抗体61：10稀释的经纯化的鸡IFN．Y重组蛋向LnaelPoly—clonalAntibodyofRabitforChickenbyDiIuted5TimesLane2Poly—clonalAntibodyofRabitforChickenbyDiluted25TimesLane3Poly—clonalAntibodyorRabitforChickenbyDiluted507rimesLane4Poly-clonalAntibodyofRabitforChickenbyDilutedl00TimesLane5Poly-clonalAntibodyofRabitforChickenbyDiluted200TimesLane6PuridRecombinantChickenIFN．ybvDiluted0Times3-8琼脂扩散实验Fi93—8AgarDiffusionExperiment 4讨论佐剂(Adjl2Vants)是先于抗原或与抗原同时注入动物体内，能非特异性地改变或增强机体对该抗原特异性免疫应答的物质，亦称免疫增强剂(王明俊，1987)。其作用机理包括：(1)提高疫苗抗原的生物学或免疫学半衰期；(2)增进将抗原递送至APC及APC对抗原的加工和提呈；(3)诱导免疫调节因子的产生(李连奋，1997；柳钟勋，1997)。目前所应用的佐剂有很多类型，例如包括弗氏佐剂在内的油佐剂。近些年来，由于对免疫原的深入研究，所提抗原纯度越来越高，甚至有些是合成的抗原肽或基因工程抗原肽。由于其免疫原性通常很弱，因此，非常需要用佐剂来增强其免疫原性或提高宿主对抗原的保护性应答。于是对佐剂的研究广泛发展起来。免疫佐剂可刺激机体对免疫原较早、较强、较久的应答，尤其当抗原数量很少时，其作用更为明显。特别是可以用不同的佐剂和疫苗配方来调控免疫应答向细胞免疫和体液免疫方向发展，即朝THl和TH2方向发展，调控诱生抗原的类别和亚类，促进黏膜免疫等。现代免疫学己证实，有些病原体引起疾病需要抗体来保护，即要求引起Tn2型免疫，而另一些病原体引起的疾病则需要细胞免疫来保护，即THl型免疫应答。然而，由于传统佐剂不易降解，可引起一些不良反应，包括接种部位的局部炎症，甚至形成肉芽肿或无菌性脓肿。在实验动物中观察到的对佐剂的全身反应包括不适、发热、佐剂性关节炎和前眼色素层炎。这些反应常由佐剂与抗原本身的相互作用而引起，或可能由于佐剂引起的对特定抗原的应答类型以及疫苗中佐剂引起的细胞因子类型不同而引起。随着新型疫苗的不断出现，对新型疫苗佐剂的需求也越来越大。而随着细胞因子的深入研究．其佐剂效应与治疗效果受到广泛关注。因为细胞因子是天然的免疫分子，对机体没有任何毒副作用。根据分泌细胞因子的不同，可以将Ti细胞分为Ta0、Tal、TH2型T细胞(Wood，1996；Londonetal，1998)。THl细胞主要分泌IL一2、IFN-y、TNF—B等，以介导与细胞毒和局部炎症有关的免疫反应，参与细胞免疫及迟发型超敏反应的形成。又称为炎性T细胞。其在抗胞内病原体(病毒、细菌、寄生虫等)感染中发挥重要作用。TH2细胞主要分泌IL-4、IL．5、IL一6、IL一10等细胞因子，其功能主要为刺激B细胞增生并产生抗体，与体液免疫相关。一般认为TH细胞前体在抗原刺激下，分化为中间阶段的TH0细胞，进而在不同因素作用下选择向Tal或T82细胞分化。IFN—Y可诱导THl细胞分化，但抑制Ta2细胞增生。相对于哺乳动物，禽类免疫系统的研究比较滞后，暂时还没有报道说明禽类是否存在THl和Ta2细胞亚型极其作用。与鸡的IFN-y相比，入IFN—Y在SDS-PAGE凝胶电泳上表现的分子量为20．25kd，凝胶过滤分子量为45kD·蛋白质分子量为17kD。小鼠IFN-Y基因位于第10对染色体．也有3个内含子和4个外显子，成熟的小鼠IFNoy有136个氨基酸残基。人和小鼠IFN．y的氨基酸序列有40％的同源性。1998年以来，国外学者分别利用新城疫病毒(Heller，1997：Marcus，1999)、马立克氏病毒(Volpinietal，1996：Levyetal，1999：Xmgetal。2000)、沙门氏菌(Guligetal，1997：Baoetal，2000：Farnelletal，2001)、艾美尔球虫(Patriciaetal，1997：Dimiereta1．1998：Lillehojetal，1998：Dimieetalr，1999：Rothwelletal，2000；Yunctal，2000)等作为抗原与鸡[FN。Y联合应用，证明了鸡IFN—Y对免疫细胞的作用。鸡IFN．Y可提高细胞表面免 痰相关抗原(1mmuneassociatedantigen，la)的寝达。抑制正常脾细胞对裔丝分裂原刺激所产生的增擞。同时提出了鸡IFN．Y的饿剂效应机制与巨嗽细胞的激活(Hussainetal，1998)致NO(Djeraba，2000)豹产煞箨殍}豫骏-2’,y-=襞纯酶(Indoleamina2,3-dioxygenase，IDO)的产生有关(Thomasetal，1993)。NO及含N介质对多数细菌、寄生虫、病毒均可产生抑制作用，同时，NO还具有抗肿瘤活性。诱导NO合成酶(InducibleNOsynthase，iNOS)位予匿噬细稳系，是编鹳NOS瓣基因，NOS活纯掰可产生丈量NO。狂瀚呷遥进键迸IDO的生成使色氨酸降解，从而抑制微生物与肿瘤细胞的生长。1130可将色氮酸分解为尿氨酸与N-单酰萋最氦藏。这种代谢披认为可与病擐竞争色氟酸瑟使瘸愿豹增骧受到搀制(Schults坟al，1995)。与哺乳动物稆简，鸡IFN。Y是遥道激活iNOS来发挥抗微生物及抗增麓作甩(Kampiahetal，1993：Weietal，1995)。Famell等(2001)阐明沙门氏菌的脂多糖可刺激巨噬细胞产生ILd2，瓣IL-12霹裁激T缀藏窝凇细羟产生珏瑙一￥，IFN-y激活巨璇鲴缒扶{l莛上调NO的分泌，在达到一定浓度时，NO负调节T细胞和NK细胞产生IFN-Y(Famelletal，2001)。Dimier等在抗艾美尔球虫免璇中，将鸡骨髓巨噬绷胞与鸡胚成纤维细胞用含祷鸡IFN-y的上清液颈楚瑶24h，捧铡了球虫静增殖，瓣裙7IFN-￥的傍掰(Dimier蝣丑l，1998；Dimieratal。1999)。利用小鼠实骏证明。作为非特异性免疫反应效应因子，IFN吖在抑制寄生虫增骥上起重要作用。与嚏乳动物胡同，鸡[FNo￥可抑制瘪疹性口焚刺激的璃蔽纾维缎胞痍变，麴裁丝裂骧刺激的鸡巨噬细胞的生长活性，诱撵激活的鸡胚成纤维细胞和融噬缅胞表达MHCH，并诱导巨噬细胞产生NO。1999年利用劳斯肉瘤病毒(RousSarcomavirus，RSV)诱导游发生瓣癌熬实验涯骥，鸡IFN一￥斡挽病毒嚣搜龌予鸡IFN-8，缎律为主委黪巨噬绥熬滋嚣荆，IFN-v可抑制肿瘤的发生(Plachyetal，1999)。Virgil等(2000)证明，大肠秆黼表达的IFN．o／8、IFN．Y和IL．1B在与抗原联合应用时可不同程度调节酋免、二熊对的抗体应答，螅与抗簸及年龄毒哭，其撬病毒活槛嚣能与不楚熬表这系统毽鸯关系(SchijBsetal，2000)。Lambrecht等于1999年对天然璃IFN—Y岛重组鸡1FN-Y的生物学活性进行了比较(LambrecMetal，1999；Michatskietal，1999)。他们分别角抒状瘸毒与大炀耔蓥表达7鸡IFN．Y，荠舄丝裂藤刺激鸡薅{棒巴细斑掰褥到的必然鸡IFN-y进行了生物学话性比较。实验证明杆状病毒表达的踅组鸡IFN-Y蛋白的理化特性和生物学活性与天然鸡IFN-Y相似，能够掷铡鸡疑或终缝缨黪串弱病毒鬟锄势激瓣吞噬缨勰产生NO。在感繁豹毙虫缎戆土瀵渡孛可获得杆状病糖表达的鸡IFN-Y100～300ug／ml。荷大肠秆蒲原核表达系统所表达的鸡IFN-y缝纯化后浓度可超过100ug／ml，可以特定方式激活HDll巨噬细胞系，但没有发现其有抗癃毒活性。臻簧髂多}垮葬丝裂骧裁激瓣瓣缎蕤霹{瓣备天然薯：挠素，鬣所褥天然千撬素浓度较低(5ng／m1)并污染膏其它细胞因子。而且需要利用实验幼物。这样～来，由于提高了成本面不利于大规模应用。近年来，髓着基鞠体外重缀技术的发展，魁餐重组蛋魏变褥篱单、易行。根据Song等(1997)的报导，证实了鸡IFN—Y有抗瘸毒活性及MAF滔性。而鼠由于耱蒸他掺馋盼不同，真援表达系统(cos-致CEC-32缨臆)产生戆鬟缀鸡l羚l。￥熬撬瘸毒瑟性及MAF活性高子原核表达系统(大肠杆菌)所产生的熏组鸡IFN+Y。在疑ConA刺激后10min，IFN-y的mRNA开始表达并持续24h以上。但在外周血淋巴细胞(Peripheralbloodlymphocytes，PBL)释游漭己缨糙孛mRNA数袁选瘩平势苓耱嚣。簿辩巴缁耱率IFN+Y的 燃‘燃舞鼍黑耀篁攀鼍皇尊端鼍掣雹皇燃舞型舞鼍茎l鼍舞鏊兰甍鼎舅燃墨暑燃皇型燎曼葛麟麓躺邕皇邕燃鼍$!ss!鹭燃承平始终商子PBL。尽管现在还不溥楚这一反应机制，但Notlhemblot和RT-PCR分析表嘲，纛丝装鞭蘩|激籍寝达IFN-￥懿mRNA逐速壤热，在2h内这凳|巍蜂，趣精逐渐下降·这表骥IFN．Y麓戮是一翠麓激矮蒸嚣。太豚栉翦表达的重组j晦IFN-y的分子羹大约先17一l$kD，与其氮纂黢序列攘譬出的分子羹一致。箍寞援袭这系绫搿袤这的鹩IF'N-￥和ConA激活脾漆巴细斑瓣产盎的端IFN-￥静努予耋舞26027kD。这释簇凳爵携楚由耱萋诧蘩慷静誉潜舔选壤酶。该试验诞明了鸡IFN-￥燕巨噬蹦臌躲激涟物，诱肆的NO产生，瑟艇鸡IFN一￥霹戳爨藏MHCl秘MHCll类撬骧鞭梭镪憨的魄剿以及焱噬缁爨MHC熟袭这萋。跌上这戆特点，都是[FN-￥嚣蠹疫髓後裁匏攥谂依据。与国外研究魄较，辫内对鹏IFN-y的研究起步较晚，戗括IFN-v在内的璃细施因子懿骚凳糖瓣落嚣，缺乏耋缀湾IFN-￥虽鑫及撬鹋IFN，￥鬣壹鹳参竞隆或挚竞隆藏悔等薹础磷突试剂，累但是逵残耜美耩究滞磊瓣主要骧斑，嚣显壕燕疆建遴一步遴簿滚A研究瓣霍要嚣索。遥年来RT-PCR接零越来越多她残翔于梭潮组织戏细耱串特定基西mRNA表达姻承平，显被涯朔爨≤}常露教豹，避被擎多攀耆成功瓣栗臻(CookeNEetal，1991：刘箍程等。2000)。程缎巍戳子麴疆必审，RT-PCR：巽麓抉速遮势攒嚣一缨飓残缀躐孛一系弼鳃艇爨予慧疆瓣激遮水平，丽盈所辫灏扳静爨较少。缎是，我法也存在举能耩确定量麴研究靶绷齄戮予mRNA静绝对水平，并藏应糟RT-PCR方法检测鳓的mRNA袭遮水平柱莱麓倩况下不隧党垒反应黧缡羁熬蟹鑫矮亵这承平等疑点。我嚣】壤据翟静豹摄遵毙隆翻7薅IFN．￥蓁魏，蔻避一步研究其在免疫调节及撬黪絷兔痰审瓣穆翅努下基端，这其窈熏要貔理论意义。选择台适的载体蹩目的基因躲嚣成功表达的关键。强翦广泛用乎，}瓣基因袭_逸的系统礴两类，～韪源核表达系统。翔E．coli裘这系统；茄一类燕寞辕液遮系统，如德乳渤貔寝达蓉绞、琵囊缀藏表遮蘩魏等。由手E．cofi藉予墙莽、成本舔，表达蛋囱可丈蟹生产，又藉于缝倔，还辘诱发规体的拣体威应，拥之人们己jl重箕萋因续搀及表这调控琢溅霄了较雾敬了解，掰以强前被广泛莱翊。通鬻姆外源蒸秘导入劐Kcoli串主要用予嵩簸表达蛋白囊。在摄建璜的缱纯、定位及功能分辑方霹有～定价德。舔核袋达藏体要求商一个强的启动子及其辫侧躲谖控彦磁；簧寿s转彦列；sD痔剜母怒始密璐予之润豢霄金逶靛瑟离；纛竞隧萋戮与瘤动予之闻要搿蓬确豹凝壤挺槊；≯}源基羧下游热入苓蔹藏p霆子豹转最终止予嚣，教选择套逶鹃载体是翻的嫠因樽驻褒达的关键。本实骏所采用的竣俸pPROEX糊H_r具礴Trc强艘动予，怒一个专港韩源蓦谶程E．coli串裘达鹩燕效原谈表遮系统。pPROEX'O'‘HT大小为4．7轴，具搿鬟带毒莓素辘性(A瓣|)选择耩记、ll令多党酝霞赢(MCS)，1话痿动予和laelq基霹使褥可鼹IPTG诱导袭达。并虽在其pTrc与多竟爨使杰之阔寡6令缀蘸羧，数其淡这瓣融会蛋鑫带窍6)(H趣标签，辫科艇=贽嬲离子与组氨羧缝合鲤健威塞接纯纯表达的融合虽鑫，戆攀方蠖-6×His标签分子薰，j、，生璞菸辞下举带奄褥，因而蒺零上不彰响羁静餐自舱结鞫岛功齄。壤越本赛验将尧酶凝褥魏骧璐端IFN-v爨鑫鹣罄瓣噩巍隆至蓦壤表达载律龋黼神}狂孛，艇其在太骚拇蔼DH58中谶行了裹效袭达。穗凌逮孛臻终落凌荛0,6raMl凇诱导，孳：不嚣时阍离心收集菌休，SDS·PAGE分析，绩果衰鹎程诱导精的l～8小融均裔融食蛋囱的袭达，基谯该辩海毅瘀，缱潺导辩淘翱长，秘鹣蛋鑫翡裘这蠢罐多，至8小对逡捌最大馕，凝胶薄攫获度强接显示鸡IFN-￥鬃鑫豢熬表述爨约占蘧俸墓蛋鑫30％黻上，疆露裘这耄帮始下降。 东北农业大学农学硕士学位论文说明诱导8小时为最佳收获时间。如果菌体过度培养，氨苄青霉素逐渐失活、菌体老化、死亡、分解等因素均可导致表达量下降。本次实验中表达的蛋白质主要以包涵体形式存在。包涵体主要由重组蛋白和一些菌体杂质组成。其中包括RNA聚合酶、细菌膜蛋白、rRNA和质粒DNA等。当细菌在较短时间内表达较多的外源蛋白时，往往容易形成包涵体。包涵体的形成，可使在胞内表达的外源蛋白不易被细菌的蛋白酶所降解，同时也有利于重组蛋白的分离纯化。已有大量的研究表明，鸡的细胞因子蛋白大多为糖基化蛋白。虽然原核表达系统不能有效地将表达产物进行糖基化。但用该系统表达的重组鸡细胞因子同样具有类似于对应天然蛋白的生物学活性，说明糖基化对细胞因子生物学活性的影响不大(DigbyMRetal，1995；SundlckRSetal，1997)。因此，我们仍然选择了目前较为成熟的、以包涵体形式高效表达外源蛋白的策略。本实验证明，我们可以利用大肠杆菌获得大量的重组蛋白．其方法简单易行。而且价格低廉，适用于大规模制备所需的重组蛋白，既为今后的研究奠定了基础，也为其大规模生产带来了光明的前途。 结论5结论5．1应用反转录．聚合酶链反应技术，从ConA诱导培养24h的鸡脾淋巴细胞中扩增得到了大小约500bp的基因。序列分析表明，该基因开放阅读框架由492个核苷酸组成，与国外报道的鸡IFN．Y基因序列完全一致。表明试验成功克隆得到了鸡IFN-Y基因。为进一步研究鸡IFN．Y基因的表达奠定了物质基础。5．2将克隆到的鸡IFN．Y基因转化到大肠杆菌DH5a中，经诱导表达分子量约22ku的蛋白质，薄层灰度扫描表明表达量约为33％，经SDS-PAGE凝胶电泳及WestenBlot检测结果证明此表达产物为预期的融合蛋白·获得的融合蛋白同样可刺激兔产生抗体．为鸡IFN—Y重组蛋白生物学特性及其应用的研究打下了坚实的基础。5．3以所获得的重组鸡IFN—Y融合蛋白及其纯化产物为免疫原．免疫兔制各兔抗鸡多克隆抗血清。经琼脂扩散实验鉴定，证明鸡IFN-Y融合蛋白为良好的免疫原。为下一步研究提供了重要的实验材料。 。。。。。。，，端。，鍪篓璺鋈墼墼鍪墼二—，。，，。，—一参考文献1冀非力主编．医学免疫学CM】．科学出版社，19982盎冬雁等译．分子克隆实验指南(第二版)[M】．科学出版社，19923攀连奁。免疫佐裁豹发震概况，擞生秘学免疫学避震，1997，25(2)：57．614林学颜、张玲主编，现代细胞与分子免疫学(M】．科学出版社5刘胜旺、扎宪剐、陈洪岩等．应用反转录聚含链式反应检测鸡Thl榉港巴暖子mRNA袋达。中阐预防兽医学报，2000，22：48·526柳钟勋．新型免疫怯剂在疫苗中的应用．中华微生物学和免疫学杂志，1997，17(9)：337—34l7孙卫民、正惠琴编著．细胞因子方法学【M】．人民卫生出版社，19998摄明俊．免疫佐剂．兽医生物制品，1987，1379诲剑琴．§《逢薪毽纪孛善医学【M1．jE京：孛国农韭大学斑舨社，199810AlbinaJE，AbmeJA，etal，Nitricoxideproductionisrequiredformudneresidentperitonealmacrophagestosuppressmitogen-stimulatedTceltproliferationp】。TheJournalofImmunology,1991，147：144-1481BaoS,BeagleyKW：Interferon—YplaysacriticalroleinintestinalimmunityagainstSalmonellatyphimuduminfection[J]。Immunology,2000,99：464-47212BenenciaF，CourregesMC，Nitricoxideandmacrophageantiviralextrinsicactivity【J】．Immunology,t999，98：363-37013BemasconiBD，SchultzU&Staeheti嚣Theinterferon-inducedMxproteinofchickenlacksantivimlactivity．JInterferonCytokineRes．，1995，15：47—5314ConwayG．Thedoublygreenrevolution：foodforthe2l“century【M】。Cornetluniversitypress，NewYork,USA，1998．I5DigbyMR，LowenthalJW．Cloningandexpressionofthechickeninterferon—Ygene[J]．JInterferonRes,t995，15：939-94516Dijkmans＆CreemersJ&BilliauA．Chickenmaerophageactivationbyinterferon：dobirdslackthemolecularhomologueofmammalianinterferon-gamma【J】．VetImmunolImmunopathot，1990，26：319-33217DimierIH，InhibitionofEimeriatenelladevelopmentinvitromediatedbychickenmacrophagesandFibroblaststreatedwithchickencellsupematantswithIFN一￥activity暇．AvianDis,1998，42：239-24718DimierIH．MechanismsoftheEimedatenellaGrowthInhibitoryactivityinducedbyconeunavalinAandreticuloendotheliosisvirussupematantswithinterferongammaae重ivilvinchickenmacrophageandfibroblasts川．AvianDis，1999，74：65．7419DjembaA，BemardetN，etal，NitricoxideinhibitsMarek’sdiseasevirusreplicationbutisnotthesigledecisivefactorininterferon—Y-mediatedviralinhibition溺．Virology,2000，277：58．65 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