慢病毒感染细胞 操作手册.pdf

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1、慢病毒感染细胞实验方法1/4一、实验概述培养生长状态良好的目的细胞，根据慢病毒感染预实验结果设计各组实验条件，进行正式感染。若为荧光标记的慢病毒感染，参照预实验确定的感染时间点，于荧光显微镜下观察GFP表达情况，荧光率达70-80％左右，细胞汇合度达80%左右，收集细胞进入下游实验。若为抗性基因（如Puromycin）标记的慢病毒感染，感染48h-72h后，使用抗生素筛选48h，收集细胞汇合度70%-80%左右的生长状态良好的细胞进行下游实验。二、实验材料1.主要试剂试剂名称试剂来源cat.No.胎牛血清Ausbia

2、nVS500TDMEMCorning10-013-CVR胰酶生工生物工程（上海）股份有限公司T0458-50GPuromycinClontech631305D-Hanks上海吉凯基因技术有限公司配制2.主要仪器仪器名称仪器来源cat.No.荧光显微镜奥林帕斯IX71CO2培养箱日本三洋SANYOMCO-175倒置显微镜上海蔡康光学仪器有限公司XDS-100离心机赛默飞世尔科技(中国)有限公司Fresco21生物安全柜上海振样创空气净化设备有限公司Bio1200-Ⅱ-A2三、实验步骤1．准备目的细胞（1）从液氮罐中取出

3、细胞冻存管，迅速放入37℃水浴中，并丌时摇动使其尽快解冻。（2）完全解冻后，1300rpm，离心3min，75%酒精擦拭冻存管消毒后，移至生物安全柜。（3）吸去冻存液上清，加入1mL新鲜的完全培养基重悬细胞，将细胞悬液接种至含有3mL完全培养基的6-cmdish中，轻轻晃匀后置于37℃、5%CO2培养箱。（4）24h后更换一次培养液继续培养，待细胞汇合度达80%左右传代培养，保持细胞良好的生长状态。2/42．目的细胞慢病毒感染（1）贴壁细胞：a.处于对数生长期的细胞胰酶消化，完全培养基制成3-5×104个/mL细胞悬

4、液，并根据表1接种相应的细胞数到培养板中，继续培养保证感染时铺板量达到15-30%左右。表1.贴壁细胞接种和病毒感染时感染液体积底面积接种体积换液体积296孔板0.3cm100µl100µl248孔板0.6cm200µl200µl224孔板2cm500µl500µl212孔板4cm1ml500µl26孔板10cm2ml1ml2T25瓶25cm5ml2.5mlb.按照预实验结果，参考表1更换感染培养基，加入最适病毒量进行感染。c.参照预实验结果，选择感染后最适时间点更换为常规培养基继续培养，一般为感染后8-12h左右。

5、（2）悬浮细胞：a.按照预实验确定的感染条件，使用感染液将细胞制成3-5×105个/mL悬液，并根据表2接种相应的细胞数到培养板中。表2.悬浮细胞接种体积底面积接种体积248孔板0.6cm200µl224孔板2cm500µl212孔板4cm1mlb.铺板后无需培养，参照预实验确定的MOI加入最适病毒量感染。c.参照预实验结果，选择感染后最适时间点，一般为8-12h左右，将各孔中细胞收集到干净的1.5mlEP管中，以2000rpm离心2min，去掉上清液，更换为完全培养基，轻轻混匀后继续培养（备注：如48孔板感染可扩大

6、至24孔板继续培养）。3．观察感染后细胞状态及感染效率（1）细胞状态良好，未出现大量死亡现象，特别是保证NC组不CON组细胞状态相当。（2）一般而言，细胞感染效率达到70%以上，就可以继续下游实验。a.荧光标记的慢病毒感染。感染后72h左右，荧光显微镜观察报告基因（如GFP）的表达情况，荧光率即为阳性感染率；b.抗性基因标记的慢病毒感染。一般于感染48-72h后，换用含抗生素（如3/4puromycin)的培养基筛选细胞，细胞存活率即为阳性感染率。4．细胞状态良好，感染效率合格组，可用于下游检测；否则重新感染。注：操

7、作时污染了病毒的管子和枪头以及培养基和最后的细胞都需要用消毒液处理后才能丢弃。4/4