高通量测序技术简介教学内容.ppt

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1、高通量测序技术简介Roche454焦磷酸测序PyrophosphateSequencing基本原理454sequencing：EmulsionPCR(emPCR)MixDNALibrary&capturebeads(limiteddilution)“Breakmicro-reactors”IsolateDNAcontainingbeadsGenerationofmillionsofclonallyamplifiedtemplatesoneachbeadNocloningandcolonypickingCreate“Water-in-oil”emulsion+P

2、CRReagents+EmulsionOilPerformemulsionPCRAdaptercarryinglibraryDNAABMicro-reactorsAdaptercomplementEnrichAnnealSeqprimerCentrifugeStepLoadEnzymeBeads454sequencing：DepositionofDNAbeadsintothePicoTiter™PlateLoadbeadsintoPicoTiter™PlateIlluminaSolexa合成测序SequencebySynthesize基本原理ClonalSin

3、gleMoleculeArrays单分子克隆~1000moleculesper~1µmcluster~1000clustersper100µmsquare~40millionclustersperexperimentPrepareDNAfragmentsLigateadaptersAttachsinglemoleculestosurfaceAmplifytoformclusters20micronsSequenceReversibleTerminatorChemistry可逆终止反应OPPPHNNOOcleavagesitefluor3’blockNext

4、cycleIncorporationDetectionDeblock;fluorremovalODNAHNNOO3’O5’free3’endXOHAll4labellednucleotidesin1reactionSequencing-by-Synthesis(SBS)5’GTCAGTCAGTCAGT3’5’CAGTCATCACCTAGCGTAFirstbaseincorporatedCycle1:AddsequencingreagentsRemoveunincorporatedbasesDetectsignalCycle2-n:Addsequencingre

5、agentsandrepeat1、每轮测序反应加入四种带有荧光标记的dNTP，末端带有可以被去除的阻断基团2、每轮反应只能整合一个核苷酸，仪器读取相应的荧光信号3、信号读取结束，用化学方法去除阻断基团，进行下一轮测序反应123789456TTTTTTTGT…TGCTACGAT…Theidentityofeachbaseofaclusterisreadofffromsequentialimages根据每个点每轮反应读取的荧光信号序列，转换成相应的DNA序列BasecallingfromtherawdataSolexa测序WorkflowABISOLiD连接法测序

6、SequencebyLigation基本原理文库制备：微珠单分子克隆1024种8碱基探针4色荧光，4种双核苷酸，每色荧光有256个探针(4^6)SOLiD利用探针的连接反应读取模板的DNA序列连接法测序（一）每个探针进行检测的两个碱基后面有三个匹配碱基，因此一条测序引物读取的序列是不完整的测序引物与adapter退火探针连接，检测荧光切除荧光基团第二轮探针连接，检测荧光切除荧光基团连接法测序（二）测序引物沿着Adapter移动5次，确保每个位点都被检测连接法测序（三）0位置是Adapter的最后一个碱基，因此只检测一次，该碱基是进行解码所必须的。Adva

7、ntage&disadvantage454sequencing读取长度大，400bp可以对未知基因组进行从头测序denovosequencing当遇到polymer时，如AAAAAA等，荧光强度和碱基个数不成线性关系，判定重复碱基个数有困难Solexasequencing高度自动化的系统读取片段多，适合进行大量小片段的测序，如microRNAprofiling基于可逆反应，随反应轮数增加，效率降低，信号衰减，读取序列较短，给denovosequencing拼接带来困难SOLiDsequencing每个碱基读取两次非常高的准确性，特别是对于SNP的检测灵活的系统

8、，完善的磁珠编码系统，可以进行样品的p