大黄蒽醌提取物对嗜水气单胞菌的抑菌作用

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1、FishSci(2011)77:375–384DOI10.1007/s12562-011-0341-z大黄蒽醌提取物对嗜水气单胞菌的抑菌作用卢春霞，王洪新，吕文平，徐跑，朱健，谢骏，刘波，娄在祥收稿日期：2010年11月14日/接收日期：2011年2月28日/在线发布时间：2011年4月13日日本水产科学2011年摘要：测定大黄及其主要生物活性化合物对嗜水气单胞菌的抑菌性能。采集不同种植区的大黄，对其主要生物活性化合物（蒽醌衍生物）进行超高效液相色谱（UPLC）测定；大黄的抗菌活性[最低抑菌浓度（MIC）]与蒽醌含量（r=0.9306，P<0.

2、01）呈正比关系。五个嗜水蒽醌类化合物的MIC值范围在50-200μg/mL。动作模式研究表明，蒽醌类（大黄素）穿透细胞膜后结合细胞DNA，导致细胞死亡。目前的研究表明，蒽醌类大黄提取物作为抗菌剂对嗜水的控制具有潜在用途。关键词：大黄、嗜水气单胞菌、UPLC、抗菌性能介绍：嗜水气单胞菌（Aeromonashydrophila）属于弧菌科、气单胞菌属，广泛分布于淡水，污水，污泥，土壤和食品中。是一种重要的鱼类细菌病原体，并与其余几个鱼类疾病，如出血性败血症，鳍和尾腐烂，流行性溃疡综合征相关[1，2]。这些疾病已引起淡水鱼高死亡率，导致世界各地广泛

3、损失。用于控制这些疾病的抗生素和化疗药物可能会导致抗药性细菌的发展，环境污染，残留的鱼。随着对有机水产养殖的需求不断增加，在水产养殖中使用比抗生素副作用小的天然产品颇受欢迎[3-6]。大黄是一种重要的中国草药（称为大黄），在中国已长时间被广泛作为植物药物进行治疗气血凝滞，便秘，精神疾病和肾脏疾病，以及代替泻药。大黄，蒽醌衍生物[大黄素，大黄酚，大黄酸，芦荟大黄素，大黄素甲醚（图1）和其糖苷]被认为是主要的活性成分，具有多种不同的生物活性和药理性质，如抗氧化剂[7]，抗菌[8]，抗病毒[9]，抗真菌[10]，抗动脉硬化[11]，和抗癌活性[12]

4、21FishSci(2011)77:375–384DOI10.1007/s12562-011-0341-z。由于其生物效应，人们越来越愿意购买这些药物。近期文献表明，大黄能促进鱼和虾非特异性免疫系统功能，防止致病性感染，缓解拥挤压力的负面影响，促进生长[6,13]。以往所有的历史研究主要在于筛选大黄及其主要组成部分的抗菌活性和嗜水性，也出现了很多对其作用机制的报道，但很少讨论其抗菌成分。图1五种蒽醌结构因此，本次工作目的是：（1）从大黄及其主要成分中筛选出对嗜水气单胞菌有抑制作用的提取物；（2）检测不同种植区采集的大黄五种蒽醌；（3）调查嗜水蒽

5、醌的作用机制。材料和方法微生物和化学品/试剂嗜水气单胞菌TPS-30，BSK-10是由浙江省淡水水产研究所提供，IB101，JG101，4LNS301，CCH201，LNB101，CG101是中国水产科学研究院淡水渔业研究中心惠赠；八大黄样品在中国大黄品种产地附近的市场采购。大黄素，大黄酚，大黄酸，芦荟大黄素，大黄素甲醚（纯度>99％）由科密欧化学试剂公司（中国上海）提供。离心柱基因组DNA21FishSci(2011)77:375–384DOI10.1007/s12562-011-0341-z提取试剂盒购自加拿大BioBasic公司。细胞PI

6、凋亡检测试剂盒购自中国南京注册机生物技术有限公司。溴化乙锭（EB）是购自Amersco公司（梭伦，OH，USA）。超高效液相色谱级甲醇购自Sigma-Aldrich公司（圣路易斯，密苏里州，美国）。其它分析级试剂均由中国上海国药集团化学试剂有限公司提供。蒽醌类化合物的提取干燥大黄研磨成细粉，并通过筛子（60目）通过。大黄粉末（10.0g）用100ml80％乙醇混合，并进行萃取，在80℃下加热2h，并重复三次。合并提取液，过滤，然后用旋转蒸发器在40℃下减压浓缩，并用冷冻干燥机冷冻干燥（LGJ-10D；四环科学仪器（北京）有限公司，中国）。然后将

7、粗提取物样品储存于4℃冰箱直至使用。超高效液相色谱分析超高效液相色谱（UPLC）分析使用配备有Waters的AcquityPDA检测器（美国Waters公司），并采用AcquityUPLCTMBEHC18柱（100mm×2.1mm，颗粒尺寸1.7μm的超高效液相色谱仪；美国Waters公司）。柱箱温度固定在45℃。洗提液为：A，水0.1％甲酸，B，乙腈/甲醇（20:80，V/V）。梯度程序为：10％-30％B（15min），30-100％B（18min）以0.3/min恒定流动。当蒽醌化合物的峰值在280nm处时进行监测。在线记录从200到60

8、0nm的UPLC分析紫外—可见吸收光谱。21FishSci(2011)77:375–384DOI10.1007/s12562-011-0341-z嗜水