大黄蒽醌提取物对嗜水气单胞菌的抑菌作用

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大黄蒽醌提取物对嗜水气单胞菌的抑菌作用卢春霞，王洪新，吕文平，徐跑，朱健，谢骏，刘波，娄在祥收橘日期：2010年11月14日/接收日期：2011年2月28日/在线发布时间：2011年4月130日本水产科学2011年摘要：测定大黄及其主要生物活性化合物对嗜水气单胞菌的抑菌性能。采集不同种植区的大黄，对其主要生物活性化合物（葸醌衍生物）进行超高效液相色谱（UPLC）测定；大黄的抗菌活性［最低抑菌浓度（M1C）］与蒽醌含量（r=0.9306,P〈0.01）呈正比关系。五个嗜水蒽醌类化合物的M1C值范围在50-200ug/mL。动作模式研究表明，蒽醌类（大黄素）穿透细胞膜后结合细胞DNA,导致细胞死亡。目前的研究表明，蒽醌类大黄提取物作为抗菌剂对嗜水的控制具有潜在用途。关键词：大黄、嗜水气单胞菌、UPLC、抗菌性能介绍：嗜水气单胞菌（Aeromonashydrophila）属于弧菌科、气单胞菌属，广泛分布于淡水，污水，污泥，土壤和食品中。是一种重要的鱼类细菌病原体，并与其余几个鱼类疾病，如出血性败血症，鳍和尾腐烂，流行性溃疡综合征相关［1'2］。这些疾病已引起淡水鱼高死亡率，导致世界各地广泛损失。用于控制这些疾病的抗生素和化疗药物可能会导致抗药性细菌的发展，环境污染，残留的鱼。随着对有机水产养殖的需求不断增加，在水产养殖中使用比抗生素副作用小的天然产品颇受欢迎大黄是一种重要的中国草药（称为大黄），在中国已长时间被广泛作为植物药物进行治疗气血凝滯，便秘，精神疾病和肾脏疾病，以及代替泻药。大黄，蒽醌衍生物［大黄素，大黄酚，大黄酸，芦荟大黄素，大黄素甲醚（图1）和其糖苷］被认为是主要的活性成分，具有多种不同的生物活性和药理性质，如抗氧化剂［7］，抗菌［8］，抗病毒t9j,抗真菌％，抗动脉硬化［11］，和抗癌活性［12］。由于其生物效应，人们越来越愿意购买这些药物。近期文献表明，大黄能促进鱼和虾非特异性免疫系统功能，防止致病性感染，缓解拥挤压力的负面影响，促进生长t6*13j。 以往所有的历史研究主要在于筛选大黄及其主要组成部分的抗菌活性和嗜水性,也出现了很多对其作用机制的报道，但很少讨论其抗菌成分。图1五种蒽醌结构因此，本次工作目的是：（1）从大黄及其主要成分中筛选出对嗜水气单胞菌有抑制作用的提取物；（2）检测不同种植区采集的大黄五种蒽醌；（3）调查嗜水蒽醌的作用机制。材料和方法微生物和化学品/试剂嗜水气单胞菌TPS-30,BSK-10是由浙江省淡水水产研究所提供，IB101,JG101，4LNS301,CCH201,LNB101,CG101是中国水产科学研究院淡水渔业研究中心惠赠；八大黄样品在中国大黄品种产地附近的市场采购。大黄素，大黄酚，大黄酸，芦荟大黄素，大黄素甲醚（纯度〉99%）由科密欧化学试剂公司（中国上海）提供。离心柱基因组DNA提取试剂盒购自加拿大BioBasic公司。细胞PI凋亡检测试剂盒购自中国南京注册机生物技术有限公司。溴化乙锭（EB）是购自Amersco公司（梭伦，OH，USA）。超高效液相色谱级甲醇购自 Sigma-Aldrich公司（圣路易斯，密苏里州，美国）。其它分析级试剤均由中国上海国药集团化学试剂有限公司提供。蒽醌类化合物的提取干燥大黄研磨成细粉，并通过筛子（60目）通过。大黄粉末（10.0g）用WOml80°/。乙醇混合，并进行萃取，在80°C下加热2h，并重复三次。合并提取液，过滤，然后用旋转蒸发器在40°C下减压浓缩，并用冷冻干燥机冷冻干燥（LGJ-10D;四环科学仪器（北京）有限公司，中国）。然后将粗提取物样品储存于4°C冰箱直至使用。超高效液相色谱分析超高效液相色谙（UPLC）分析使用配备有Waters的AcquityPDA检测器（美国Waters公司），并采用AcquityUPLCTMBEHC18柱（100mmX2.1mm，颗粒尺寸1.7um的超高效液相色谱仪；美国Waters公司）。柱箱温度固定在45°C。洗提液为：A，水0.1%甲酸，B，乙腈/甲醇（20:80,V/V）o梯度程序为：10°/o-30°/oB（15min），30-100°/oB（18min）以0.3/min恒定流动。当蒽醌化合物的峰值在280nm处时进行监测。在线记录从200到600nm的UPLC分析紫外一可见吸收光谱。嗜水气单基因组DNA的提取使用离心柱基因组DNA分离试剂盒从嗜水TPS-30中提取DNA。提取DNA的纯度通过吸光度比A260/A280（OD260/OD280=1.83）进行检查。DNA的浓度用UV-2100分光光度计（信息中心）M在260nm处的吸光度（A260=1.0外径为501^/1111）来确定。 抗菌活性（MIC）大黄提取物，其主要成分（蔥醌衍生物）的抗菌活性通过使用双重微量肉汤稀释法测定。将生长至对数中期的肉汤在37°C下培养16小时，采用两倍稀释法将80ul的测试样品转移到试管中，使最终浓度分别为6400,3200,1600,800，400,200,100，50，25,12.5，6.25和Oug/ml，这就是以往装满1900u1的LB培养基。细菌悬浮液（20ul）加到每个试管中形成单位为106（CFU）/ml的最终浓度。将试管在37°C下放置24小时。培养后，微生物的生长是通过估算浊度的增加来确定的，用UV-2100分光光度仪在630nm处测量MIC。计算菌株的完全抑制的最高稀释度。所有分析一式三份，并将各自的中值用于数据分析。细菌膜通透性嗜水气单胞菌TPS-30，生长至对数中期，在37°C培养16小时，并收集，洗涤，并重新悬浮于lml的去离子水中（吸光度在630nm处调节至0.2）。将大黄素样品溶液2试管（10ul）在37°C中放置任意时间。然后，将细胞悬浮液以lOOOOrpm离心10min，并且将上清液稀释至100倍［16］。释放钾离子的量即由原子吸收光谱仪（美国Varian公司光谱学与机管局220）测定。透射电子显微镜指数细菌与2MIC大黄素在37°C下培养4小时后，通过离心收集，去离子水洗涤两次。处理后，将细菌沉淀物固定，固定在2.5°/。的戊二醛缓冲液中1小时。然后将细胞固定在1%的四氧化锇缓冲液中lh，用1%乙酸双氧铀将整块染色，脱水，分级乙醇浓度，并随后嵌入骨刺树脂。所用的缓冲液为0.1M的二甲胂酸钠（pH7.4）。制备聚乙烯醇缩甲醛的铜网切片，并用2%醋酸双氧铀和柠檬酸铅［17］染色。青霉素作为阳性对照，和双蒸水作为阴性对照。正常工作条件下，用透射电子显微镜(H-7000；日本日立公司)进行观察。 流式细胞仪分析大黄素治疗后膜的完整性是使用碘化丙啶的流式细胞术分析(PI)为探针［18:的。嗜水TPS-30，生长至对数期和大黄素在2MIC的浓度混合4h，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)在37°C下洗涤细胞3次，并重新悬浮于106CFU/ml的缓冲液中。37°C温度条件下，在大黄素处理过的细胞培养中的PI溶液(50ug/ml的终浓度)处理30min,随后多次用PBS洗涤除去未结合的染料。H是在488nm处使用氩激光，将得到的焚光发射通过一个660-nm的长通滤光器收集。青霉素作为阳性对照，双蒸水作为阴性对照。使用FACScan仪器(刀魂，BO,USA)进行流式细胞分析。荧光测量大黄素在没有和嗜水基因结合时存在的荧光光谱测量，使用F-7000荧光光度计(日本日立公司)，在室温下激发波长为290nm(KEX=290nm)。从360至560nm的荧光光谱的变化，测定为增加浓度(0,5.0,10.0和20mg/mL)，加入大黄素与固定浓度(200mg/mL)［19］的Tris-HCl缓冲液(10mM，pH7.2)的样品作为空白溶液，可用于所有样品。有竞争力的大黄素约束力和EB细菌脱氧核糖核竞争性结合的荧光测定，使用F-7⑻0荧光光度计(日本日立公司)。将DNA溶解于2ml的Tris-HCl缓冲液(10mM，pH7.2)中，将lOug/ml，lOulEB(2uM)溶液加入到DNA溶液后，在EB-DNA溶液置于37°C的恒温水中10分钟。不同浓度的大黄素(0,50,100,和200ug/ml)加入到EB-DNA溶液，30分钟后，用荧光光谱测定各试验溶液，激发535nm处，记录从550到720nm的［2°’213光谱。此试 验是在一个1厘米长度的石英池中进行。KI荧光猝灭本实验是根据由郭某人［19］和宋某等［22］人描述的方法进行并稍做修改。大黄素的浓度调整为200ug/ml；碘化钾(KI)溶解在Tris-HCl缓冲液(lOmM,pH7.2)中，最终至浓度为0，1，2，4，6，8，和lChnmol的不同浓度。然后将不同浓度的磯化钟加入含有或不含DNA(10ug/mL)的大黄素溶液中。发射360至560nm的光谱并固定290nm激发波长。数据绘制按照Stern-Volmer方程L23jFO/F=1+KSV［Q］;其中和F分别是在荧光强度下DNA的不存在或存在，KSV是斯特恩一涹莫猝灭常数，［Q］是浓度的淬灭剂。结果大黄蔥餛类化合物的测定大黄粗提取物的超高效液相色谱分析结果示于表1和图2。从不同种植区采集的5种大黄蒽醌类化合物的总含量范围为5.87±0.30至24.86±0.81mg/g。大黄的抗菌活性(MIC)与蒽醌含量相关(r0.9306,P〈0.01)呈正相关。 I•jiiwifta.12-H±0.42}.81士MB225::DJ®3571(179腿0Prw.0.43iMl5.63±022關.92ftffiS士MUt)2；：:D.016.95士(ISL.2iOG腳Rrv.0.(171193±0.61士W22.91：:24说士⑽1DM5bixi9.S±05i1細5123士鵬12.821(161■5YimaiPry.].腫16W士1).41LSIifljK1110-)(4I5h■Mid®■5NciDKn.jPrDV1.53i0.M&01揃141z'W7D.lf士MI3l.<4：:DjXI235±a5lI56i01Ginsufta.“SB0.(151211御Wi'115IS士D.I32.1h:D.l(3.76±a«隱0G醒:ProvO.IOiO.KK1.2/±0.1)62.71±DJ1|J)I：:DiM5.87士OL.2i0表1不同种植地区的大黄抑菌活性及蒽醌含量(mg/g)之间的关系结果表示为平均值士标准差(n=3)。株，嗜水TPS-30M1C最小抑制浓度b3403003253SO375图2标准溶液(S)和样品1,2,3,4,5,6,7,8中大黄提取物的色谱图a芦荟大黄素，b大黄酸，大黄素c,d大黄酚，e大黄素甲醚蒽醌类化合物的抗菌活性五种蒽醌类的抗菌活性(MIC)列于表2。五种蔥醌对嗜水的MIC值介于50〜200ug/ml，其抗菌活性存在的一般顺序为：大黄素=大黄酸=芦荟大黄素〉大黄素甲醚=大黄酴。考虑到抗菌活性和大黄素的含量，大黄素被选为该类抗菌机理的候选蒽醌衍生物。 MIC(pg/ml)StrainPhyscionChrysophanolEmodinRheinAloe-emodinA.hydrophila旧101200200505050A.hydrophilaJG101200200505050A.hydrophilaTPS-30200200505050A.hydrophilaBSK-10200200505050Ahydrophila4LNS301200200505050A.hydrophilaCCH201200200505050A.hydrophilaLNB101200200505050A.hydrophilaCG101200200505050表2五种蔥醌对嗜水气单胞菌的抗菌活性细菌膜通透性大黄素对嗜水细菌膜的透过性，通过大黄素处理后的细胞释放的钾离子的量的影响作为测定。当细菌细胞膜被破坏，在一定程度上，小的离子，如钾和磷酸倾向于滤出，我们可以监测从细胞中释放的胞质成分。图3显示了细菌细胞培养后钾流出，诱导后钾离子外流显著。而增加孵育时间0.5〜4h，当时间进一步增加，对轻微的变化进行了观察。为钾离子经过处理后释放量增加提供了证据，这就说明大黄素可能作用于细胞膜增加通透性，进而引起细胞离子泄漏。 图3大黄素对K离子嗜水TPS-30释放量的影响。细胞用大黄素预定次数处理，测定细胞中K离子的释放相对量透射电子显微镜Eddcol父JOcnouJVS!lrol9y在透射电子显微镜下观察，用大黄素处理过的细菌细胞的形态学变化。电子显微照片见图4。未经处理细菌的对照细胞保持完整，并呈现出光滑的表面（图4a）。而且，培养4h后，该细胞表现出重要的形态变化，例如细胞壁和膜破坏，而且观察到细胞胞质内容物泄漏图4b，c）中，它类似于在先前的研究[25]图4嗜水TPS-30大黄素处理（b）或青霉素（C，阳性对照），以及未处理的透射电子显微镜观测（一） 流式细胞仪分析调查大黄素的抗菌作用是否作用于损伤的质膜中，细胞与大黄素和PI。PI是一种荧光染料，可嵌入到核酸的可行性标记，这是为了穿透细胞并污染其丧失完整性的膜［26］。检测单个细胞内部的PI是通过流式细胞仪分析。如图5，而未经大黄素处理的细胞是97.15%，没有H荧光信号（图5a），表明活细胞不包括H染料。然而，当大黄素和青霉素，71.65%和嗜水气单细胞的81.5%处理品进行荧光标记孵育4h后，分别（图5b，c）中，结果表明大黄素诱导PI流入细胞。图5大黄素的影响流式细胞仪测量。记录荧光信号的增量代表由细菌细胞的P1摄取。细胞（a）未经大黄素处理，细胞（b）经大黄素处理，细胞（c）经青霉素处理。 荧光光谱研究[27]分光光度滴足嗜水大黄素与基因组DNA，在0-20ug/ml的浓度范围内，提供了有关大黄素与DNA相互作用模式的信息。如图6所示，大黄素具有较强的内源荧光，若无DNA，在290nm光激发的波长峰值约为425nm。当逐渐增高的DNA浓度（5.0，10,和20ug/ml）加入到该大黄素溶液中，大黄素的荧光强度逐渐降低。原因可能是大黄素合成碱基对的DNA螺旋，从而导致电荷转移激发态的变化，导致更低的荧光［19］的转移和变化的嵌插。排放减少，在药物和DNA"7j之间图6没有嗜水气单基因组DNA下的大黄素荧光光谱（a），在Tris缓冲液（pH7.2）中的基因组DNA（B-D）。大黄素的总浓度：200ug/ml。细胞路径长度：lcm,a=0,b=5.0,C=10,D=20ug/ml的DNAAIOSJU!ssosalonlLL大黄素、EB与细菌DNA的竞争性结合为了证实DNA与大黄素的相互作用的模式，竞争性结合实验进行了使用EB作为探针。EB是可与DNA结合的最敏感的荧光探针之一。游离EB的荧光低，但与DNA结合，DNA双螺旋结构的相邻碱基对嵌入后就能产生强烈的荧光发射。这种增强荧光可以当作它与一个共存 瘁火试剂分子经历了类似的反应。这可以被用来监测结合模式，从而指示化合物防止EB嵌入0似［28］的能力。因此，该实验是通过用大黄素滴定EB-DNA体。当大黄素的浓度增加时，在EB-DNA体系的荧光显著下降，观察到在590nm处（图7）迖到最大值。这表明，部分EB被大黄素在EB-DNA体系中取代，且EB是由疏水性环境释放到水溶液中的。此结果表明，大黄素与DNA结合的嵌入模式［21’29］。100-IOOOOO8642Alps-sjsssaJonlLL.5405605SO6€O620640660680700720740Wavelength(nm)图7有竞争力的大黄素和EB与嗜水基因组DNA的结合：控制（2umEB+10ug/ml的DNA），B2umEB+lOug/ml的DNA+50ug/ml的大黄素，C2umEB+10mg/ml脱氧核糖核酸+100Pg/ml的大黄素和d2pMEB+10pg/ml脱氧核糖核酸+200ug/ml的大黄素KI荧光猝灭在碘负离子是动态猝灭剂，可决定小分子与DNA的作用方式，可通过计算碘负离子对小分子的荧光淬灭效果来确定。当小分子插入到DNA的碱基，这些碱基（在DNA双螺旋结构）连同带负电荷的磷二酯骨架，抑制阴离子猝灭剂靠近小分子，从而导致碘负离子W的猝灭效应弱化。如图8所示Stern-Volmer曲线，当DNA缺失或存在时的KI猝灭效应。荧光猝灭分别得到Y二1.0151+0.069X,r=0.998,与Y=1.0015+0.045X,r=0.998。碘大黄素的淬灭常数为0.069L/mmol，但DNA中含有碘化钾大黄素的淬灭常数为 0.045L/mmol。如图8所示，不存在DNA时，增加碘化钾浓度大黄素以浓度依赖性的方式引起高效的荧光猝灭。若存在DNA时，碘化钾表明大黄素的荧光效应相比较差。这一现象表明，大黄素可能与DNA以嵌入模式结合，导致淬火分子的碰撞频率减少，因此DNA具有保护作图8Stern-Volmer曲线，没有（a）或（b）存在DXA时，大黄素对顺序添加礁化钾的荧光淬灭，DNA=10.0ug/ml；EGCG=200ug/mlo讨论大黄抗菌活性的分析表明，该粗提取物显示出对大黄嗜水、抗菌活性（MIC）与蒽醌含量呈正相关的（r=0.9306，P〈0.01）。这表明，蒽醌类是大黄中对嗜水增长的主要抑菌成分。然而，根据中等收入国家的平均嗜水值（50-200ug/ml）（表2），五种蒽醌表现出不同的抗菌活性:大黄素，大黄酸，芦荟大黄素菌株的作用均大于黄素甲醚、大黄酚。之前已有论文［8’24］表明，这类蒽醌衍生物的抗菌活性可能与分子结构上的取代基类型相关的。所有这些蒽醌衍生物具有相同的双羟基蒽醌核，由C9和C10上的2个酮基，和C1和C8上的2个羟基组成，而不同的基团取代苯环上的C3和C6（图1）。三种蒽 醌类（大黄酸，大黄素，和芦荟大黄素）分别具有极性取代基的羧基，羟基和羟甲基的C3,C6,和C3。据报道，极性官能团（羧基，羟基，和羟甲基）的存在可以提高抗菌活性[8.24]虽然大黄素甲醚和大黄酚也具有C1和C8（图1）的羟基，非极性甲基、弱极性甲氧基可能削弱大黄酚和大黄素甲醚的抗菌活性。大黄素，是重要生物活性化合物的一种，已经呈现出各种药理学活性，如抗炎［31］，抗氧化［7］，抗菌w和抗肿瘤活性［32］。这种广泛的生物活性，它们的分子机制在少数情况下已经被阐明。尤其是大黄素对嗜水气的抗菌活性和机制已很少有人研究。要了解对嗜水抗菌活性的机制，在这里我们需要调查处理细胞的形态和大黄素与DNA相互作用的分子机制。有以下几种可能的机制提出。破坏细菌的细胞壁和细胞膜的能力，作为渗透屏障显示了结构完整性和膜的损失。在我们的实验中，FACScan分析表明，大黄素增加细胞膜的渗透性使ONPG流入细胞（图5），并造成大量钾离子从处理过的细胞（图3）流出。此外，形态学变化和胞质内容物泄漏也证明了大黄素治疗嗜水细胞的电子显微照片（图4）。所有的结果阐明了大黄素增加细胞膜通透性，导致细胞内的内容物泄漏。细胞死亡可能是细胞内容物泄漏或自溶过程的结果[33]本文阐述的实验和以往的报告123’^表明，大黄素能结合并嵌入细胞膜，导致细胞膜完整性的损失。那么，什么是大黄素插入细胞内呢？它可以作用于细菌细胞内的目标？以前的研究已证明，中国的大黄蒽醌衍生物能抑制大分子合成细胞［35’36］， 也被推测为穿透目标细菌细胞膜的通透剂。因此，我们研究了大黄素对嗜水基因组DNA的杀菌活性的分子机制。有趣的是，荧光光谱研究表明，大黄素能结合DNA的磷酸基团并融合入DNA螺旋碱基对，这表明DNA可能是这个蒽醌的抗菌活性，这可能会影响复制和转录，抑制目标表迗，甚至导致细胞死亡［36］O此外，大黄素的抗菌活性可能涉及其他行动模式。以前的研究已经表明，蒽醌衍生物可以抑制烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD11)氧化酶和线粒体琥珀酸盐氧化酶［37］的活性。因此，我们建议，大黄素可能抑制呼吸链中细菌脱氢过程的电子传递，底物氧化。这种抑制可导致氧化分解磷酸化作用，产生次分解产物［33’36］。致谢感谢农业部水产动物遗传育种学和水产养殖生物学(BZ2009-24)重点开放实验室的支持，中国现代农业产业技术研发体系专项基金(nycytx一49)o 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