重组人胸腺素β4基因的克隆、表达、纯化、鉴定及活性检测

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1、重组人胸腺素β4基因的克隆、表达、纯化、鉴定及活性检测【摘要】目的:利用基因工程的方法原核表达重组人胸腺素β4(Tβ4)并对其进行纯化和鉴定.方法:使用大肠杆菌偏爱密码子合成人Tβ4全长基因,构建了Tβ4的二串联体基因(Tβ4②),将其克隆入表达载体pET22b(+)中,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态,IPTG诱导表达后,经盐析、疏水层析和离子交换层析纯化重组蛋白,采用免疫印迹和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱对重组蛋白进行鉴定.结果:获得了纯化的重组Tβ4②蛋白,并具有生物学活性.结论:成功构建、表达和纯化了Tβ4②,为其功能研究奠定基础.【关键词】胸腺素β

2、4串联重复序列克隆分子基因表达0引言胸腺素β4(thymosinbeta4,Tβ4)广泛分布于各组织、器官和细胞中,与免疫功能、神经发育和肌动蛋白功能密切,还可抗炎,促进血管生成〔1〕、创伤愈合〔2〕、毛囊发育〔3〕,修复受损的心肌〔4〕.虽然Tβ4有着广泛的应用前景,但由于其分子太小，难于直接在大肠杆菌中表达.目前用于实验室及临床试验的Tβ4主要为化学合成品,价格昂贵,使其应用受到限制.我们利用基因合成与PCR技术,构建了Tβ4的二串联体基因（Tβ4②）表达载体,在大肠杆菌中成功地表达和纯化了该串联体,为进一步的研究奠定了基础.1材料和方法1.1材料质粒pET22b(+)

3、，大肠杆菌DH5α及BL21(DE3)由本中心保存;人Tβ4全长基因、测序(北京奥科生物技术有限责任公司);引物(上海英峻生物公司);限制性内切酶NdeⅠ,BamHⅠ,SalⅠ,T4DNA连接酶以及DNAMarkerDL2000(TaKaRa);TaqPCRMix(天根生化科技有限公司);B型质粒小量提取试剂盒,小分子量DNA片段高效快速回收试剂盒(北京博大泰克生物基因技术有限责任公司);蛋白分子质量标准(Fermentas);兔抗人Tβ4多克隆抗体(Abcam,ab14334);HRP山羊抗兔IgG,DAB显色液(北京中杉金桥生物技术有限公司);IPTG,琼脂,琼脂糖,M

4、TT(北京鼎国生物技术有限责任公司);PhenylSepharose6FastFloacia);ConA(华美生物工程公司),小鼠淋巴细胞分离液(天津灏洋生物制品科技有限责任公司),胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司),RPMI1640(Gibco),Tβ4化学合成品(ProSpecTany),其他试剂均为国产分析纯;BALB/c小鼠,雄性,6~8周龄(第四军医大学实验动物中心).1.2方法1.2.1重组Tβ4②基因的克隆按照大肠杆菌惯用密码子及人胸腺素β4氨基酸序列设计并合成了编码Tβ4的全基因片段,5＇和3＇末端分别带有NdeⅠ和BamHⅠ酶切位点,将其克隆入pE

5、T22b(+)中,NdeⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定后,将其命名为pET22b(+)Tβ4①;合成两条引物,上游引入BamHⅠ酶切位点,下游引入SalⅠ酶切位点及终止密码子TAG,以pET22b(+)Tβ4①为模板进行PCR扩增,PCR产物经BamHⅠ和SalⅠ双酶切后克隆入pET22b(+)Tβ4①中,BamHⅠ和SalⅠ双酶切鉴定并测序,命名为pET22b(+)Tβ4②.1.2.2重组Tβ4②的表达重组质粒pET22b(+)Tβ4②转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,挑取阳性克隆接种于含氨苄青霉素100mg/L的LB培养液中,37℃震荡培养过夜,(

6、a)以1∶100分别转接入六个试管中,继续培养2h(A600nm=0.5)后,其中一管作为诱导的阴性对照,另五管分别加入终浓度为0.01,0.05,0.1,0.5,1mmol/LIPTG,继续培养4h,离心收集菌体行SDSPAGE;(b)以1∶100分别转接入两个试管中,继续培养2h(A600nm=0.5)后,其中一管作为诱导的阴性对照,另一管加入终浓度为0.01mmol/LIPTG,每隔1h收集菌体进行SDSPAGE.1.2.3重组Tβ4②的I1640调整细胞浓度,加入ConA使其终浓度为2.5mg/L,按每孔4×105细胞加入96孔细胞培养板中,37℃孵箱培养6h后,

7、加入重组Tβ4②和Tβ4化学合成品,终浓度分别为2,4,8μmol/L,继续培养72h,MTT法测定淋巴细胞的增殖和分化.2结果2.1PCR及酶切和序列鉴定人Tβ4基因的PCR产物经0.2g/L琼脂糖凝胶电泳检测,在约135bp处可见特异性条带(图1),该片段大小与预测结果一致.分别用限制性内切酶NdeⅠ和SalⅠ,NdeⅠ和BamHⅠ,BamHⅠ和SalⅠ双酶切pET22b(+)Tβ4②,在270bp处可见重组Tβ4②基因及135bp处的Tβ4基因片段(图2).测序结果为序列正确的重组Tβ4②基因