何首乌及其混伪品序列相关扩增多态性反应体系的优化

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1、何首乌及其混伪品序列相关扩增多态性反应体系的优化【摘要】　　目的建立何首乌及其混伪品序列相关扩增多态性（SRAP）分子鉴定技术体系。方法正交优化影响SRAP-PCR的Mg2+、dNTPs、引物浓度与Taq聚合酶量。结果20μl反应体系的优化组合为：Mg2+2.5mmol/L，dNTPs0.4mmol/L，引物0.35μmol/L，Taq酶1U。结论Mg2+、dNTPs、引物浓度与Taq聚合酶量对不同物种SRAP-PCR结果有不同程度影响，利用SRAP分子鉴定前应对此4因素进行优化。【关键词】何首乌混伪品序列相关扩增多态性优化　　Abstract：Ob

2、jectiveInordertocharacterizePolygonummultiflorumThunb.anditsadulterants,theSRAPmolecularmarkersystemizetheconcentrationsofMg2+,dNTPs,primersandTaqDNAolymerase.ResultsTheoptimumsystemof20μlmol/L,dNTPs0.4mmol/L,primer0.35μmol/L,TaqDNApolymerase1U.ConclusionTheconcentrationsofMg2+

3、,dNTPs,primers,TaqDNAolymerasehavedifferenteffectintheresultofSRAP-PCRindifferentspecies.ItisnecessarytooptimizethesefourfactorsbeforeusingSRAPtoidentitydifferentspecies.　　KeymultiflorumThunb.;Adulterants;SRAP;Optimize　　何首乌PolygonummultilorumThunb.是我国传统名贵中药，广东十大“道地药材”之一。近年来对其药理

4、药效研究及开发应用越来越广。据研究报道其药用化学成分主要有蒽醌类、二苯乙烯类、芪类、多糖类等〔1～4〕。何首乌具有降血脂〔2〕、增强免疫〔3〕、抗氧化〔4〕、护脑〔5〕等多种药效。除入药外，还被用于制取洗发水、首乌酒、保健品、食品和饲料添加剂等，开发前景十分广阔〔6〕。　　然而，何首乌出现混伪品的历史久、地域广。本草中有混淆品宕芋的记载；河南、河北、甘肃、宁夏等地也有将翼蓼、毛脉蓼误做何首乌使用的历史〔7〕；湖北省武当山、竹山、竹溪、房县均有把混淆品耳叶牛皮消作何首乌使用的习惯〔8〕，且有不法商贩雕刻芭蕉块根为“人型何首乌”出售。混伪品的出现严重阻碍

5、何首乌科研及应用，因此对何首乌及其混伪品的鉴定显得至关重要。　　序列相关扩增多态性(Sequence-relatedamplifiedpolymorphism，SRAP)以操作简单、稳定性高、多态性丰富、易于测序〔9～12〕等优点在种质鉴定〔13〕、遗传多样性分析〔11〕、遗传连锁图构建〔14〕、基因连锁标记寻找〔9〕与基因的遗传变异〔14，15〕等方面得到广泛应用。且Ferriol等〔16〕发现与其它分子标记相比，SRAP在分子水平上与传统在形态学水平上建立的物种分类鉴定更加吻合。　　SRAP分子鉴定技术基于PCR反应。一个优化的PCR反应体系极其

6、重要，这关乎样本DNA所能扩增的条带数、清晰度及稳定性，从而影响后续的统计分析。为建立何首乌及其混伪品SRAP分子鉴定技术，本文首次对何首乌及其混伪品SRAP-PCR反应体系的主要影响因素进行了优化，以期为何首乌及其混伪品鉴定提供前提条件。　　1材料和方法　　1.1材料实验所用引物及物种见表1～2。实验所用DNA聚合酶，TaKaRaTaq(DR001AM)。BSA（牛血清白蛋白），购自TaKaRa。　　表1实验所用引物（略）　　1.2DNA提取用TIANGEN的DNAsecurePlantKit提取经硅胶干燥保存的各物种叶片DNA，紫外分光光度法和琼

7、脂糖凝胶电泳法检测DNA质量合格，稀释为50ng/μl，-20℃保存。　　表2实验所用物种（略）　　1.3SRAP-PCR扩增采用L16(45)正交实验设计，对总体积为20μl的SRAP反应体系中的Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Taq聚合酶浓度进行4因素4水平的优化分析(表3～4)，共16个处理。其它成分为：DNA模板（50ng/）1μl、Buffer（10X）2μl、BSA（0.1%）0.2μl，超纯水补足使终体积为20μl。所用引物对为me17-em1。　　表3PCR反应的因素与水平（略）　　扩增程序：94℃预变性5min；95℃变性1

8、min，35℃复性1min，72℃延伸1min，5循环；94℃变性1min，48℃复性1min，72℃延伸1