何首乌及其混伪品序列相关扩增多态性反应体系的优化论文

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1、何首乌及其混伪品序列相关扩增多态性反应体系的优化论文【摘要】目的建立何首乌及其混伪品序列相关扩增多态性（SRAP）分子鉴定技术体系。方法正交优化影响SRAP-PCR的Mg2+、dNTPs、引物浓度与Taq聚合酶量。结果20μl反应体系的优化组合为：Mg2+2.5mmol/L，dNTPs0.4mmol/L，引物0.35μmol/L，Taq酶1U。结论Mg2+、dNTPs、引物浓度与Taq聚合酶量对不同物种SRAP-PCR结果有不同程度影响，利用SRAP分子鉴定前应对此4因素进行优化。【关键词】何首乌混伪品序列相关扩增多态性优化Abstract：ObjectiveInordertocharact

2、erizePolygonummultiflorumThunb.anditsadulterants,theSRAPmolecularmarkersystemizetheconcentrationsofMg2+,dNTPs,primersandTaqDNAolymerase.ResultsTheoptimumsystemof20μlmol/L,dNTPs0.4mmol/L,primer0.35μmol/L,TaqDNApolymerase1U.ConclusionTheconcentrationsofMg2+,dNTPs,primers,TaqDNAolymerasehavedifferente

3、ffectintheresultofSRAP-PCRindifferentspecies.ItisnecessarytooptimizethesefourfactorsbeforeusingSRAPtoidentitydifferentspecies.KeymultiflorumThunb.;Adulterants;SRAP;Optimize何首乌PolygonummultilorumThunb.是我国传统名贵中药，广东十大“道地药材”之一。近年来对其药理药效研究及开发应用越来越广。据研究报道其药用化学成分主要有蒽醌类、二苯乙烯类、芪类、多糖类等［1～4］。何首乌具有降血脂［2］、增强免疫［

4、3］、抗氧化［4］、护脑［5］等多种药效。除入药外，还被用于制取洗发水、首乌酒、保健品、食品和饲料添加剂等，开发前景十分广阔［6］。然而.freelplifiedpolymorphism，SRAP)以操作简单、稳定性高、多态性丰富、易于测序［9～12］等优点在种质鉴定［13］、遗传多样性分析［11］、遗传连锁图构建［14］、基因连锁标记寻找［9］与基因的遗传变异［14，15］等方面得到广泛应用。且Ferriol等［16］发现与其它分子标记相比，SRAP在分子水平上与传统在形态学水平上建立的物种分类鉴定更加吻合。SRAP分子鉴定技术基于PCR反应。一个优化的PCR反应体系极其重要，这关乎样本D

5、NA所能扩增的条带数、清晰度及稳定性，从而影响后续的统计分析。为建立何首乌及其混伪品SRAP分子鉴定技术，本文首次对何首乌及其混伪品SRAP-PCR反应体系的主要影响因素进行了优化，以期为何首乌及其混伪品鉴定提供前提条件。1材料和方法1.1材料实验所用引物及物种见表1～2。实验所用DNA聚合酶，TaKaRaTaq(DR001AM)。BSA（牛血清白蛋白），购自TaKaRa。表1实验所用引物（略）1.2DNA提取用TIANGEN的DNAsecurePlantKit提取经硅胶干燥保存的各物种叶片DNA，紫外分光光度法和琼脂糖凝胶电泳法检测DNA质量合格，稀释为50ng/μl，-20℃保存。表2实

6、验所用物种（略）1.3SRAP-PCR扩增采用L16(45)正交实验设计，对总体积为20μl的SRAP反应体系中的Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Taq聚合酶浓度进行4因素4水平的优化分析(表3～4)，共16个处理。其它成分为：DNA模板（50ng/）1μl、Buffer（10X）2μl、BSA（0.1%）0.2μl，超纯水补足使终体积为20μl。所用引物对为me17-em1。表3PCR反应的因素与水平（略）扩增程序：94℃预变性5min；95℃变性1min，35℃复性1min，72℃延伸1min，5循环；94℃变性1min，48℃复性1min，72℃延伸1min，35循环；72℃延

7、伸7min。PCR在PE-2400型PCR仪上进行。1.4SRAP-PCR产物检测取8μlPCR产物与2μl上样缓冲液，混合后在含有0.5μg/mLEB的2%琼脂糖凝胶上电泳40min，Bio-Rad凝胶成像系统上观察和记录结果。表4PCR反应因素水平L16(45)正交实验设计μl（略）2结果2.1正交实验结果按表4分别对9物种进行PCR反应后，所得产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测（见图1）。图19物种SRAP-