衔接蛋白2敲除对at1受体介导的angⅱ内吞的影响

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1、衔接蛋白2敲除对AT1受体介导的AngⅡ内吞的影响：张勇娄冬梅康劲松刘全【摘要】目的通过RNAi沉默AP2μ2亚单位的表达，观察其是否影响AT1R介导的AngⅡ内吞。方法通过设计构建的AP2μ2RNAi表达载体，转染H9C2细胞，通过ED、丙烯酰胺、N，N-二甲基双丙烯酰胺、PMSF购自美国Sigma公司;DAB、TritonX100、Tid1组、AP2plasmid2组、AP2plasmid3组共5组。以βactin表达水平作为等量蛋白质上样对照，取60μg蛋白质样品进行SDSPAGE电泳，转至硝酸

2、纤维素膜上;室温封闭2h后，用含0.01%Tin;加入相应的AP2μ2抗体(1∶200)，4℃孵育过夜，TBST漂洗3次后加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶1000)，37℃摇床温育2h，最后经DAB显色，凝胶图像分析系统分析蛋白的表达。　　1.2.2给予AngⅡ不同时间点观察其在H9C2细胞内的内吞变化过程将合适尺寸的盖玻片高压灭菌，放入24孔板内，种入适宜的细胞浓度。待细胞融合度达到60%～70%时，，加入AngⅡ10-7mol/L，分别于5、15、30和60min终止药物作用，4%多聚甲醛固定30min

3、。1%TritonX100作用10min;PBS洗3次，5min/次;3%H2O2室温10min，PBS洗3次，5min/次;非免疫动物血清，室温15～20min，倾去多余液体，不洗，滴加特异性一抗，室温半小时，然后4℃过夜。PBS洗3次，5min/次。滴加荧光二抗，避光室温10～15min，PBS洗3次，5min/次。甘油封片剂封片固定，在激光共聚焦显微镜下观察并照片。　　1.2.3观察siRNA重组质粒沉默AP2μ2亚单位对AT1受体介导的AngⅡ内吞的影响将合适尺寸的盖玻片高压灭菌，放入24孔板内，种入适宜

4、的细胞浓度。待细胞的融合度达到60%～70%时，正常对照组不做任何处理，阴性对照组只加入AngⅡ10-7mol/L作用15min，转染pSH1SiAP2plasmid1质粒24h。加入AngⅡ10-7mol/L，15min，其中AP2plasmid1组细胞在加AngⅡ前30min，加苯砷氧化物(PAO)，0.25μmol/L，而不转染质粒。AP2plasmid2组细胞4%多聚甲醛固定30min。其余方法同1.2.2，最后在激光共聚焦显微镜下观察并照片。　　1.3统计学方法数据均采用x±s表示，采用SPSS11

5、.0统计软件包处理，两两比较采用t检验。　　2.2外源给予H9C2细胞AngⅡ不同时间点其内吞变化正常H9C2细胞，外源性加入AngⅡ10-7mol/L，作用不同时间点(5、15、30和60min)，激光共聚焦显微镜结果显示：5min可见H9C2细胞内可见绿色点状荧光出现，15min时，点状荧光强度最强，持续至60min时，细胞内的荧光强度达最弱。提示AT1R介导的AngⅡ内吞作用在5min时就开始发生，15min时受体内吞至胞内的数量达到最多。因此后续实验选择外源给予AngⅡ10-7mol/L，作用15min，来观

6、察细胞内吞情况(图2)。　　2.3沉默AP2μ2对H9C2细胞AT1受体介导的AngⅡ内吞的影响正常对照H9C2细胞胞浆内未见明显点状荧光;未转染质粒的细胞，外源给予AngⅡ10-7mol/L，15min后，胞浆内可见点状绿色荧光;未转染细胞加入0.25μmol/LPAO，30min后再加入AngⅡ10-7mol/L，15min后未见胞浆内有点状绿色荧光;细胞转染质粒pSH1SiAP2plasmid1，转染后24h加入AngⅡ，15min后细胞内未见点状绿色荧光，即内吞的AngⅡ(图3)。　　3讨论　　目前认为

7、RAS与许多心血管疾病联系密切，AngⅡ作为RAS的主要效应因子，除了可调节血管张力和钠盐代谢外，还可以影响心肌细胞的肥大增生，引起心脏收缩功能减弱。抑制增强的AngⅡ活性，已经被公认为是延缓心血管疾病最主要的治疗策略〔1〕。应用血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)和AT1R阻滞剂(ARB)类药物治疗急性心肌梗死后心室重构、改善心功能、降低心力衰竭发生率虽然已取得一些共识，但是ARB对患者心肌重构的远期疗效还存在争议。　　已知GPCRs的内吞方式主要分为网格蛋白依赖(Clathrindependent)的内吞和非网格

8、蛋白依赖(Nonclathrindependent)的内吞两种方式，且受体与配体内吞方式与细胞类型有关〔4〕。受体与配体复合物在内陷小窝(Coatedpits)处浓缩，在AP和其他蛋白质的参与下，网格蛋白聚集装配多聚化成网状，将胞膜拉向胞质侧，形成包被小泡(Coatedvesicle)。通过衔接蛋白复合体，网格蛋白连接到胞膜表面，同时AP也