褪黑素对花萼海绵诱癌素诱导的神经细丝过度磷酸化的影响及机制

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1、褪黑素对花萼海绵诱癌素诱导的神经细丝过度磷酸化的影响及机制【关键词】阿尔茨海默病　　摘要：目的探讨褪黑素(Mel)对花萼海绵诱癌素(CA)在成神经瘤细胞诱导的神经细丝过度磷酸化中的影响及其机制。方法采用鼠野生型成神经瘤细胞(N2aelatoninoncalyculinAinducedneurofilament(NF)hyperphosphorylationinneuroblastmacells(N2aelatoninorCAandvitaminE,thelevelsofneurofilamentphosp

2、horylationandthelevelofPP2AentledtoneurofilamenthyperphosphorylationbydecreasingthelevelandactivityofPP2A.BothmelatoninandvitaminEhadprotectiveeffectoncalyculinAinducedneurofilamenthyperphosphorylation,althoughmelatoninincreasedtheactivityofPP2AinEdidnot.

3、Morever,melatoninpartiallyattenuatedthedecreasingofPP2Alevel.ConclusionMelatoninprotectsneuroblastmacellsfromCAinducedneurofilamenthyperphosphorylationthroughtheregulationofPP2AlevelandtheincreaseofPP2Aactivity.　　KEY)、高(NFH)分子量的三种亚基组成，它与微管、微管相关蛋白(包括tau蛋白在

4、内)等其他骨架蛋白存在广泛的相互作用，并共同维持着细胞骨架的正常结构。Nancy等证实异常过度磷酸化的神经细丝也是NFTs的重要组成成分，因此其在AD发病机制中的作用也日益受到重视。褪黑素(melatonin，Mel)是由松果体分泌的一种具有多种生物学功能的内分泌激素，随着年龄的增长其分泌量逐渐下降。研究发现AD患者脑脊液中Mel的水平显著低于同年龄正常人群，临床上AD患者给予Mel后，可以改善某些患者的认知功能。因此，Mel分泌紊乱在AD的发病过程中可能起重要作用。最近有人报道，Mel可阻断或逆转冈田酸

5、(okadaicacid,OA)在神经瘤细胞(N1E115)引起的氧化应激、细胞凋亡和微管破坏。我们曾报道Mel可对抗花萼海绵诱癌素(calyculinA,CA)在SY5Y细胞引起的神经细丝过度磷酸化。为进一步研究Mel对抗CA引起的神经细丝过度磷酸化的机制，我们分别用Mel和维生素E(vitaminE,VitE)与CA同时处理成神经瘤细胞N2aa公司产品；过硫酸铵(AP)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白检测试剂盒购自美国Pierce公司；硝酸纤维素膜(NC膜)为Hybond公司产品；单克隆抗体SMI31(识别

6、磷酸化的NFH、NFM，1∶5000)、SMI32(识别非磷酸化的NFH、NFM，1∶5000)、R123d(识别PP2A的催化亚单位，1∶1500)购自Sternberger公司，所用抗体稀释液为50g/L脱脂奶粉，TBS/T配制；辣根过氧化物酶标记的二抗和ECL显色系统购自SantaCruz公司；CA购自美国Biochemical公司；γ32PATP购自北京亚辉生物医药公司。　　1.2细胞培养鼠野生型成神经瘤细胞贴壁生长细胞株(N2aInstitute,LaJolla,California,USA)提

7、供，细胞用含50g/L胎牛血清(FBS)的DMEM/OptiMEM(1∶1)培养基，在5%(体积分数)CO2、37℃培养箱内进行培养，每2-3d更换培养液一次，细胞达约70%-80%丰度时，传代或用于实验。给药处理前，细胞用无血清培养基培养12h诱导分化。细胞分为6组：正常对照组，加入含DMSO(0.01%体积分数)的培养基；CA组，加入5nmol/LCA；25mol/LMel组，加入5nmol/LCA同时加入25μmol/LMel；50μmol/LMel组，加入5nmol/LCA同时加入50μmol/L

8、Mel；100μmol/LMel组，加入5nmol/LCA同时加入100μmol/LMel；VitE组，加入5nmol/LCA同时加入50μmol/LVitE。　　1.3蛋白质印迹分析按上述分组加药处理细胞12h后，弃培养基，预冷的PBS洗2次，加入细胞裂解液90μL(50mmol/LTrisClpH8.0，150mmol/LNaCl,10mL/LTriton，1g/LSDS，0.2g/LNaN3，100mg/LPMSF，1m