褪黑素对花萼海绵诱癌素诱导的tau蛋白过度磷酸化

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1、褪黑素对花萼海绵诱癌素诱导的tau蛋白过度磷酸化【摘要】目的探讨褪黑素(Mel)对花萼海绵诱癌素(CA)在成神经瘤细胞诱导的tau蛋白过度磷酸化的影响及其机制。方法采用鼠野生型成神经瘤细胞(N2aol/LMel处理，用免疫荧光检测tau蛋白磷酸化水平，32P特异底物标记技术检测GSK3活性，免疫印迹技术检测PSer9GSK3β和GSK3β的表达水平，计算PSer9GSK3β/GSK3β的比率。结果①CA可在N2aelatoninoncalyculinAinducedtauhyperphosphorylation　　ABSTRACT:Objecti

2、veToinvestigatetheinvivoeffectofmelatonin(Mel)oncalyculinA(CA)inducedtauhyperphosphorylationinneuroblastomacells(N2aol/LMel,detectedtheleveloftauphosphorylationmunofluorescence,andassayedtheactivitiesofGSK3andtheratioofGSK3βphosphorylatedatSer9sitetototalGSK3β.ResultsCAtreatmentledt

3、otauhyperphosphorylationacpaniedultaneouslyol/LMel,theCAinducedtauhyperphosphorylation,GSK3activationandtheratioofGSK3βphosphorylatedatSer9sitetototalGSK3βdecreaseacellsfromCAinducedtauhyperphosphorylation.ItsprotectionmayberelatedtotheregulationofGSK3activityandtheratioofGSK3βph

4、osphorylatedatSer9sitetototalGSK3βincrease.　　KEYel)处理，则可对抗CA引起的上述变化[3]。糖原合酶激酶3(GSK3)是可使tau的多个位点发生磷酸化的蛋白激酶[4]。根据报道GSK3激活参与氧化应激诱导的tau蛋白磷酸化[5]，而另据报道，CA可引起氧化应激[6]，因此，我们推测CA处理诱导神经细丝磷酸化可能也与GSK3激活有关，而抗氧化剂褪黑素也可能调节GSK3活性。为此，我们分别用CA处理、Mel和CA同时处理N2aa公司产品；过硫酸铵(AP)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白检测试剂盒购自美国Pierce公

5、司；硝酸纤维素膜(NC膜)为Hybond公司产品；单克隆抗体PHF1(识别Ser396/404位点磷酸化的tau，1∶300)、Tau1(识别非磷酸化的tau，1∶500)、多克隆抗体111e(识别总tau，1∶500)购自Sternberger公司；大鼠多克隆抗体GSK3((1∶1000)、大鼠多克隆第9位丝氨酸磷酸化的GSK3(抗体(1∶1000)购自CellSignaling公司。所用抗体稀释液为50g/L脱脂奶粉，TBS/T配制；荧光素异硫氰酸盐标记羊抗鼠、羊抗兔IgG抗体购自美国Sigma公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体和ECL显色系统购

6、自美国SantaCruz公司；CA购自美国Biochemical公司；γ32PATP购自北京亚辉生物医药公司。　　1.2细胞培养鼠野生型成神经瘤细胞贴壁生长细胞株(N2aInstitute,LaJolla,California,USA)提供，细胞用含50mL/LFBS的DMEM/OptiMEM(1∶1)培养基，在5%(体积分数)CO2、37℃培养箱内进行培养，每2-3d更换培养液一次，细胞达70%-80%丰度时，传代或用于实验。给药处理前，细胞用无血清培养基培养12h诱导分化。细胞分为3组：正常对照组，加入含DMSO(<0.01%体积分数)的培养基；CA

7、组，加入5nmol/LCA；Mel组，同时加入5nmol/LCA50μmol/LMel。　　1.3间接免疫荧光染色细胞以5×105/孔的密度接种在24孔板中，孵育24-36h，待细胞生长达70%丰度时，去血清培养12h；按上述分组给药处理12h后，细胞用冷PBS洗2次，用40g/L多聚甲醛室温固定15min，PBS洗1次，0.3%(体积分数)TritonX100破细胞膜5min，10g/LBSA孵育1h；细胞再分别与适当稀释的一抗(1∶300PHF1；1∶500Tau1；1∶1000111e)在37℃孵育2h，PBS洗4次，再与二抗(荧光素异硫