应用抑制性消减杂交技术筛选ns5abp37的反式调节基因

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1、应用抑制性消减杂交技术筛选NS5ABP37的反式调节基因：张雷，马清涌，孟宪魁，李康，成军【摘要】目的应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建NS5ABP37反式激活相关基因差异表达的cDNA文库，筛选NS5ABP37蛋白反式激活相关基因。方法以表达质粒pcDNA3.1(-)NS5ABP37转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3.1(-)为对照,从转染后的细胞裂解液中提取mRNA并合成cDNA，经RsaⅠ酶切消化后将实验组cDNA分成两组，分别衔接两种不同接头，再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性P

2、CR反应;第2次PCR产物与pGEMTeasy克隆载体连接，构建cDNA消减文库，并转化大肠杆菌进行文库扩增，随机挑选克隆经PCR鉴定后进行测序及同源性分析。结果成功构建了人NS5ABP37蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA文库。扩增后得到60个200～1000bp插入片段的克隆，随机挑选其中20个测序，并通过生物信息学分析获得其全长基因序列，结果共获得9种已知功能编码基因。结论NS5ABP37基因功能涉及细胞生长调节、信号转导和能量代谢。【关键词】抑制性消减杂交;NS5ABP37;丙型肝炎病毒;cDN

3、A文库ABSTRACT:ObjectiveToscreenandidentifyhumangenestransactivatedbyNS5ABP37byconstructingacDNAsubtractivelibraryaticstechniquesptyvectortransfectedHepG2cells,themRNAthecells.SSHmethodployedtoanalyzethedifferentiallyexpressedDNAsequenceintheteRsaⅠdigestion,sm

4、allsizedcDNAsesofnestedPCR,thesecondPCRproductionidvectorstosetupthesubtractivelibrary.Amplificationofthelibraryplifiedlibrarycontained60positiveclonesedin20clonesrandomly,andthefulllengthsequencesaticsmethod.Altogether9codingsequencesaybeinvolvedincellgr

5、oetabolism.KEYix、AdvantagePCRCloning试剂盒(Clontech);Lipofectamine2000转染试剂(Invitrogen);T、IPTG、XβGal、T7和SP6通用引物及pGEMTeasy载体(Promega);Taq酶(鼎国);EcoRⅤ、HindⅢ、NheⅠ(TaKaRa);玻璃奶回收试剂盒(博大泰克)。DNA测序由上海生工公司完成。1.2方法1.2.1真核表达载体的构建根据NS5ABP37基因序列设计特异引物(P15′GATATCATGACGGAG

6、CCCGAAGACGTA3′和P25′AAGCTTTTACTTCATTAAGAAGTACTG3′)并进行PCR扩增，将扩增产物与pGEMT载体连接，转化大肠杆菌后行酶切鉴定并测序。将鉴定正确的目的基因与pcDNA3.1(-)真核表达载体连接，再次转化大肠杆菌并用碱裂解法提取质粒后进行EcoRⅤ/HindⅢ酶切分析，鉴定正确后用A，经琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度计进行定性、定量分析。1.2.3消减杂交文库的建立采用PCRSelectcDNASubtraction试剂盒，按SSH方法说明书进行。以转染

7、重组质粒和空载体的HepG2细胞的mRNA为模板逆转录合成cDNA(dscDNA)，并分别标记为实验组(tester)和驱动组(driver)，经RsaⅠ(一种识别4碱基序列的酶)消化的dscDNA形成平头末端片段。把实验组cDNA均分为两份，分别与试剂盒提供的特殊设计的寡核苷酸接头1和2R连接，然后与过量驱动组cDNA杂交;合并两种杂交产物后再继续与变性的驱动组cDNA进行第2次杂交;经巢式PCR扩增消减杂交的cDNA，使实验组cDNA中特异性表达或高表达的片段得到特异性扩增。1.2.4消减杂交文库的扩增和

8、克隆分析用HighPurePCRProductPurification试剂盒纯化2次PCR扩增后的产物，并将纯化产物与pGEMTEasyvector16℃连接过夜，转化DH5α高效感受态细胞，铺于含有氨苄青霉素的LB/Xβgal/IPTG培养平板上，37℃培养18h。挑白色菌落，以pGEMTeasy载体多克隆酶切位点两端的T7/SP6通用引物进行菌落PCR扩增，反应条件如下：95℃7min，