抑制性消减杂交

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1、抑制性消减杂交(suppressionsubtractivehybridization，SSH)技术是一种鉴定、分离组织细胞中选择性表达基因的技术.其原理是以抑制性多聚酶链反应(PCR)反应为基础的cDNA消减杂交技术.通过合成两个不同的接头，连接于测试cDNA片段的5’末端，达到选择性扩增差异性表达的cDNA片段，抑制非目的cDNA的扩增.该技术与其他消减杂交技术相比具有假阳性率低、敏感性高、效率高等优点而得到广泛应用.1抑制性消减杂交技术产生的背景高等真核生物细胞中约含有4-10万个不同的基因，但在生物体的发育过程中只有15%的基因得以表达.

2、这些基因的选择性表达决定了生物体的各项生命活动:个体的发育和分化、体内稳态的维持、细胞周期的调控、衰老、细胞凋亡等.因此要了解人体各项生命活动的调控机制，就必须将这些差异表达的基因分离、鉴定并作深入研究，为此人们建立了一系列研究基因表达差异的方法.cDNA消减杂交技术是一类较早建立的技术[1]，其原理是将要比较基因表达差异的双方cDNA进行杂交，通过羟基磷灰石层析、亲和素-生物素结合等方法，从杂交混合物中分离、鉴定出未杂交的部分.应用这些方法曾分离、鉴定出一些重要基因，例如T细胞受体(TCR)等，但不能有效获得低丰度的转录物，需多步的杂交层析过程

3、.1992年Liangetal[2,3]建立了mRNA差异显示法(mRNAdifferentialdisplay)或称差异显示逆转录PCR(differentialdisplayreverseranscriptionPCR，DD-RT-PCR),其特点是原理简单、灵敏度高，但是假阳性率高达70%.1993年Lisitsynetal[4,5]在进一步完善DD-RT-PCR基础上发展了代表性差异分析法(representationaldifferenceanalysis，RDA)，该技术充分发挥了PCR以指数扩增双链模板，而以线性扩增单链模板的特性，

4、通过消减和富集，使得目的基因片段得到特异性扩增，但仍需多次杂交、PCR步骤，较为繁琐.1994年Hubanketal[6]将RDA技术改良，设计了cDNA-RDA方法，该方法用于比较具有相近遗传背景、表型不同的两组cDNA之间的差异，但如果两组cDNA之间存在较大差异，以及某些基因在检测子中存在上调表达时，此方法显得力不从心，很难达到预期的目的.1996年Diachenkoetal[7,8]在RDA的基础上发展了抑制性消减杂交技术，他克服了DD-RT-PCR法的假阳性较高和RDA法消减杂交轮次较多的缺点，适用于克隆分析造成某种特殊表型的目的基因及

5、其功能.2抑制性消减杂交方法的原理抑制性消减杂交技术是一种以抑制性PCR反应为基础，将标准化测试cDNA单链步骤和消减杂交步骤合为一体的技术.通过合成两个不同的接头，接于经限制性内切酶消化后的测试cDNA片段的5’末端，将测试和驱动进行两轮杂交.标准化步骤均等了测试中的cDNA单链丰度，消减杂交步骤去除测试和驱动之间的共同序列.利用抑制性PCR选择性扩增目的cDNA片段，同时抑制非目的cDNA的扩增.因此，抑制性消减杂交技术显著增加了获得低丰度差异表达的cDNA的概率.所谓抑制性PCR是利用链内退火优于链间退火，使非目的序列片段两端的长反向重复序

6、列在退火时产生“锅柄样”结构，无法与引物配对，从而选择性抑制非目的序列片段扩增[9].抑制性消减杂交技术的基本实验过程如下.首先，将要进行比较的两种组织或细胞来源的mRNA样品反转录为cDNA,把含有目的基因的cDNA称为测试(tester)，把参考cDNA称为驱动(driver)，用同一种限制性内切酶RsaI切割，产生末端平头的片段，将测试cDNA分为两份,每份连接不同的接头,即:接头1(adaptor1)和接头2(adaptor2).接头为双链DNA片段，且5’-端均无磷酸基，这样保证只有接头中的长链可以与cDNA的5’-末端连接，两个接头含

7、有可识别的序列.接下来进行两次杂交.第一次杂交在每个测试里加入过量驱动，然后变性、退火，根据杂交动力学第二定律，即丰度越高的分子退火速度越快，因此测试cDNA与驱动cDNA相同片段大都形成异源双链分子，使得差异表达的单链分子得到富集.第二次杂交，将进行过首次杂交的两组样品不经变性而直接混合，只有剩下的经过消减并平均化了的差异表达的单链cDNA可以重新结合为新的杂交体分子，这种杂交体分子两端带有不同的接头1和接头2，加入新鲜变性的驱动进行第二轮消减杂交，进一步富集差异表达的杂交体分子，并用DNA酶补平末端，这样差异表达的测试序列-杂交体分子5'-和

8、3'-端就有了进行巢式PCR所需的不同的退火位点.最后，进行两次PCR反应，第一次PCR只有两端连接有不同接头的双链cDNA片段才得以指