谈灵芝多糖对哮喘大鼠肺泡巨噬细胞gitr-gitrl信号系统表达的影响

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1、谈灵芝多糖对哮喘大鼠肺泡巨噬细胞GITR/GITRL信号系统表达的影响哮喘是一种常见的儿童慢性气道炎症性疾病，发病机制十分复杂，目前认为肺泡巨噬细胞作为呼吸道固有免疫的主要作用细胞，其在吞噬凋亡细胞和清除异物的过程中会加剧哮喘气道炎症，其机制至今尚未完全阐明。糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(glucocorticoid-inducedtumornecrosisfactor，GITR)是肿瘤坏死因子受体超家族第18号成员，GITR与其配体(GITRL)结合后能加重免疫性疾病。Shin等发现GITR/GITR

2、L信号系统以既定的形式表达在巨噬细胞细胞株和小鼠腹腔巨噬细胞上，而它们在哮喘肺泡巨噬细胞上的表达如何目前鲜见报道。灵芝多糖具有抗肿瘤、免疫调节等作用，在糖尿病、免疫性疾病、肿瘤性疾病中有较强的药理活性。本研究以地塞米松(DXM)为对照，通过观察灵芝多糖对哮喘大鼠模型肺泡巨噬细胞GITR/GITRLmRNA及蛋白表达的影响，探讨灵芝多糖治疗哮喘的作用及改善哮喘气道炎症可能的分子机制。　　1材料与方法　　1.1试剂与仪器　　灵芝多糖(上海康舟真菌多糖有限公司，批号：20120220);DXM(泰生医药有限公司，

3、批号：11092010123);GITR山羊抗大鼠多克隆抗体(美国SantaCruze公司，批号：sc-34906);GITRL兔抗大鼠多克隆抗体(美国SantaCruze公司，批号：sc-66907);OVA(美国Sigma公司，Ⅴ级);逆转录试剂盒(加拿大Fermentas公司，批号：K1622);FSUniversalSYBRGreenMaster(ROX)(瑞士Roche公司);荧光定量PCR引物由上海捷瑞生物公司设计合成;GTVisionⅢ抗鼠/兔通用型免疫组化检测试剂盒(基因科技上海有限公司，批

4、号：GK500705)。7300RealTimePCRSystem(美国AppliedBiosystems公司)。　　1.2动物及分组　　40只健康♂清洁级SD大鼠，由浙江省医学科学院提供，合格证号：SCXK(浙)20080033，4周龄，体质量100~110g，随机分成对照组、哮喘组、灵芝多糖干预组和DXM干预组，每组10只。大鼠均在室温恒定(20~25℃)及灯光昼夜节律控制下清洁喂养，自由进食、进水。　　1.3哮喘模型制备　　哮喘组在第0天和第7天腹腔注射OVA/Al(OH)3混合液1mL(内含卵蛋白1

5、mg和Al(OH)3100mg)致敏。第14天开始1%1(约1-OVA溶液雾化，每天吸入1次，时间约30min，连续激发7d。灵芝多糖干预组在每次激发前0.5h给予腹腔注射灵芝多糖800mgkg1灌胃。对照组致敏和激发均以生理盐水代替OVA。-mL)灌胃;DXM干预组在每次激发前0.5h给予腹腔注射DXM1mgkg　　1.4标本制备1-　　末次激发24h后，用10%水合氯醛溶液0.3mL(100g)腹腔注射麻醉大鼠，行心脏抽血，在靠近左肺门处结扎左肺组织，经气管行右肺灌洗(生理盐水总量15mL)，回收肺泡灌

6、洗液(bronchoalveolarlavagefluid，BALF)(保证回收率>1-80%)。BALF经离心后沉淀用0.1molLPBS重悬，用于细胞计数及肺泡巨噬细胞分离。取左肺组织，经10%中性福尔马林固定、石蜡包埋、切片、HE染色，光镜下观察肺组织病理变化。　　1.5巨噬细胞分离和培养1PBS洗涤2次，加入含10%胎牛血清的DMEM培养液，取100μL接种于放有无菌圆形爬片的6-　　BALF离心后沉淀用0.1molL孔板中，其余细胞接种于细胞培养瓶中，两者均在37℃、5%CO2培养箱中

7、孵育2h;行肺泡巨噬细胞计数和台盼蓝染色、瑞氏-吉姆萨染色，加入Trizol1mL裂解细胞后用于细胞总RNA的抽提。　　1.6QRT-PCR法测定GITR/GITRL的mRNA表达80℃保存。反应条件如下：42℃-　　加入肺泡巨噬细胞经Trizol裂解后得到RNA沉淀物，逆转录成cDNA(逆转录酶购自Fermentas公司)，60min，70℃5min。引物由上海捷瑞生物工程公司合成，各基因扩增引物序列如下，GITR：上游引物5-GGGGAGCAGATGGAAGAAA-3，下游引物5-AAGGGTATTTC

8、TGGGCAAGT-3，扩增片段大小是108bp;GITRL：上游引物5-GAGGAAATGCCTTTGAGCGAGT-3，下游引物5-CCAAGGTACAGAACAGCATCAGC-3，扩增片段大小是106bp;内参基因肌动蛋白(β-actin)：上游引物5-AACCCTAAGGCCAACCGTGAAAAG-3，下游引物5-TCATGAGGTAGTCTGTCAGGT-3，扩增片段大小是259bp。实验