灵芝多糖对大鼠胰岛细胞分泌胰岛素功能的影响

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维普资讯http://www.cqvip.com·265·中国临床药理学与治疗学◇研究原著◇中国药理学会主办~1206／R．ISSN1009-2501E-mail：editoa3,s@mail．wh．al1．CI12003Jun；8(3)：265—2．68灵芝多糖对大鼠胰岛细胞分泌胰岛素功能的影响张慧娜，林志彬北京大学基础医学院药理学系，北京100083摘要目的：探讨灵芝多糖(G1．PS)对胰岛细胞分泌瘤和抗氧化作用¨J。以前的研究也表明G1．PS通胰岛素的影响。方法：分离大鼠胰岛细胞，分别观察过升高血浆胰岛素水平或影响肝脏中某些代谢酶，在葡萄糖为5．6和16．7mmol·L时，Gl—PS对胰岛对正常小鼠和四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠起降血糖细胞分泌胰岛素的影响。进一步加入不同的抑制剂作用，并可明显增强实验动物对葡萄糖的耐受观察G1．PS对胰岛细胞分泌胰岛素的影响。采用力_6，但其作用机制目前尚不太清楚。本研究旨Westernblotting观察G1．PS对胰岛细胞葡萄糖转运在探讨G1．PS对胰岛细胞分泌胰岛素的影响。蛋白2(GIJ)表达的影响。结果：在5．6mmol·L1材料和方法葡萄糖时，100mg·L的G1．PS可明显促进胰岛细胞胰岛素的分泌；当葡萄糖浓度为16．7mmol·LI1时，1．1动物Wistar大鼠舍，34周龄，6070g，购50和100mg·L的G1．PS均可明显促进胰岛细胞胰自中国医学科学院动物所。岛素的分泌。维拉帕米或维拉帕米4-EGTA均可显1．2药品和试剂G1．PS是从赤芝中提取，为一种著抑制5．6和16．7mmol·L葡萄糖时胰岛素的分含17种氨基酸的多糖，分子量为584900，多糖：肽泌，维拉帕米只能部分抑制G1．PS的促胰岛素分泌=93．51％：6．49％。多糖部分是由葡萄糖，半乳作用，而维拉帕米+EGrA则可完全抑制Gl—PS的这糖，木糖，阿拉伯糖和甘露糖等组成。RPMI．1640，种作用。在葡萄糖浓度为5．6和16．7mmol·L时，DMEM培养基购自GibcoBRL公司。胰岛素放免试G1-PS50和100mg·LI1均能明显促进胰岛细胞剂盒购自中国原子能院同位素所。胶原酶(V型)，GLUT2的蛋白表达。结论：G1．PS可能通过促进胰岛D．葡萄糖，维拉帕米(verapamil)和EGTA均购自sig．细胞GLUT2蛋白的表达从而有助于葡萄糖转运入Bnla公司。兔抗GLUT2多克隆抗体(氨基端3298细胞，促进葡萄糖的代谢，引起胰岛细胞外ca2内氨基酸)，辣根过氧化酶标记的山羊抗兔IgG和化学流而起到促胰岛素释放的作用。发光(ECL)试剂盒均购自SantaCruze公司。关键词药理学；灵芝多糖；胰岛细胞；胰岛素分泌；1．3胰岛细胞培养大鼠戊巴比妥钠腹腔注射麻葡萄糖转运蛋白2醉后，无菌取出胰腺，置于4oCHanks液中，用眼科小剪刀将胰腺剪成1r—大小的组织块，加入中图分类号：R285．5；R329．250．5g·L胶原酶，37℃恒温水浴振荡消化15min，文献标识码：A将已消化至细颗粒状组织吸出，并用大量4℃Ha．文章编号：1009．2501(2003)03．026504nks液终止消化，余下未消化完全的组织加入少量37oCnank~液，用粗口径吸管轻轻吹打，直至大部灵芝多糖(C,anodermaluc／dumpolysaccharides，分组织被消化成细颗粒状，用大量4oCHanks液终G1．PS)是灵芝的主要活性成分，具有免疫调节，抗肿止消化。混合前后两部分的消化产物，用Hanks液低速离心洗涤3次后，将组织置于含100U·ml青20o3-0"2一l8收稿2003-0"2—24修回霉素，100mg·L链霉素，11．1mmol·L葡萄糖，1Ol上海绿谷(集团)有限公司科研基金资助课题mmol·L—Hepes和7％的胎牛血清的完全RPMI．张慧娜，女，博士生。林志彬，通讯作者，男，教授，博士生导师，中国药理学会理事长，研究1640培养液中，用150目(108t-m)尼龙筛网过滤，以方向为内分泌和免疫药理学。除去未被消化的组织和结缔组织。将已分离好的胰Tel：010-6209l686(Fax)E．mail：linzb@pubhc3、bta．netca岛细胞和细胞团，置于含上述培养液内的培养瓶内——一—“一一a， 维普资讯http://www.cqvip.comChinJClinPharmacolTher2OO3Jun；8(3培养。24h后，吸出未贴壁的细胞悬液，低速离心砌·LPMSF)冰上裂解60min后，12000ipm4oC以收集细胞，显微镜下计数后，以每孔50个胰岛细离心10min，吸取上清。采用Bradford法测定上清蛋胞团接种于24孔细胞培养板内，继续培养48h后白含量J。每组分别取100p-g蛋白采用Western用于以下实验。blotting法检测GLUT2蛋白表达。1．4胰岛素含量测定吸出24孔培养板内的培养1．6统计分析所有实验数据均以±s表示，采液，细胞用Kreb．ringers液(成分单位为mmol·L)：用SPSS10．0统计软件进行统计。NaCl119，KC14．74，CaC122．54，MgSO41．19，KH：PO42结果1．19，NaHCO325，Hepes10，0．1％BSApH7．4。预孵育30min后，加入终浓度为5．6或l6．7mmol·L2．1GI-P$及其抑制剂对胰岛素分泌作用的影响的葡萄糖和12．5，25，50和100mg·L的G1．PS，孵葡萄糖为5．6mnM·L时，100mg·L的G1．PS可育1h后，吸出培养上清，测胰岛素含量。吸出24明显促进胰岛细胞分泌胰岛素，葡萄糖浓度增至孔培养板内的培养液，分别加入含5．6或16．716．7IlⅢl·L时，50、100mg·L的G1．PS均明显促mmol·L葡萄糖的Kreb．fingers液预孵育30min后，进胰岛细胞分泌胰岛素。40tanol·L的维拉帕米加入终浓度分别为40tanol·L维拉帕米或40tanol·和40tanol·L维拉帕米+0．5mmol·LEGTA均可L维拉帕米+0．5mmol·L～EGTA，孵育15min后明显抑制5．6、16．7mnM·L葡萄糖时的胰岛素分再加入不同浓度的G1．PS，孵育1h后，吸出培养上泌。葡萄糖浓度为5．6mnM·L时，40tanol·L维清，测胰岛素含量。拉帕米与G1．PS50、100mg·L合用，以及葡萄糖浓1．5GI，l】．I2蛋白表达的检测吸出24孔培养板度为16．7mnM·L时40ttmol·L维拉帕米与G1．内的培养液，分别加入含5．6或16．7砌·L葡PS100mg·L合用，胰岛素分泌量仍明显高于维拉萄糖的DMEM培养液和不同浓度的G1．PS，孵育24帕米组，但较G1．PS单独应用时明显减少。而在40h，PBS洗细胞3次，加入细胞裂解液(50mmol·Ltanol·L维拉帕米+0．5mnM·LEGTA则完全抑s-HClpH7．4，150砌·L_。NaC1，1％TritonX一制G1．PS100mg·L在5．6和16．7mnM·L葡萄糖100，5mmol·L～EGTA，5mmol·L一M．gCl2，1时的促胰岛素分泌作用(表1)。表1GI-PS对胰岛素分泌作用及抑制剂对其作用的影响(i±s。n=6)G1一PS：灵芝多糖；以每孔50个胰岛细胞团分泌量作为胰岛素分泌量；与对照组比较P<0．05，P<0．0l；与维拉帕米组比较。P<0．06；与相应单独a．Ps剂量组比较P<0．05。‘P<0．0l2．2GI-P$对胰岛细胞GI，l】．I2蛋白表达的影响100mg·L均能明显增强胰岛细胞GLUT2蛋白表在葡萄糖浓度为5．6、16．7mnM·L时，G1．PS50、达。 维普资讯http://www.cqvip.com中国临床药理学与治疗学2OO3Jun；8(3·267·GLUT2进入细胞内，该蛋白与葡萄糖激酶共同形成葡萄糖感受器，调节胰岛素的合成与分泌。本实验结果显示在葡萄糖为l6．7mmol·L时胰岛细胞GLIYI2蛋白的表达水平明显高于葡萄糖为5．6图1Gi-I~对胰岛细胞在5．6I硼·LI1葡萄糖时GLUT2mmol·L时，此结果与Ferrer等报导的结果一致|】引，蛋白表达的影响表明GLIYI'2蛋白的表达水平受培养液内葡萄糖浓GI·PS：灵芝多糖；1：对照组；2：GI·PS12．5mg·L一；3：GI．PS25mg·L一；4：GI．PS50mg·L一；5：GI．PS100mg·L一度的调节。Gl—PS在葡萄糖浓度为5．6和l6．7mmol·L均可促进胰岛细胞GLUT2蛋白的表达，且此蛋白的表达情况与Gl—PS促进胰岛素释放的作用相一致。因此，本实验推测Gl—PS通过促进胰岛细胞GLIYF2蛋白的表达从而有助于葡萄糖转运入B图2Gi．PS对胰岛细胞在l6．7I硼·L葡萄糖时GLUI~细胞，促进葡萄糖的代谢，引起胰岛细胞外Ca2内蛋白表达的影响流而起到促胰岛素释放的作用。Gl·PS：灵芝多糖；1：对照组；2：GI·PS12．5mg·L一；3：GI．PS25mg·参考文献L一；4：GI．PS50mg·L一；5：GI．PS100mg·L一l林志彬．灵芝的药理作用[A]．见：林志彬，主编．灵芝的3讨论现代研究[M]．第2版．北京：北京医科大学出版社，200l：219—53大量研究证明，一定浓度的葡萄糖可通过胰岛2MiyazakiT，NiimaM．Studiesonhlgalpolysaeeharides17．B细胞胞膜上葡萄糖转运蛋白进入细胞内，在细胞Structureexaminationofawater-soluble，anfitumorpol~saccha．内代谢产生ATP，从而增加胞内ATP／ADP的比值，rideofC,anMermaluc／dum[J]．ChemPharmBull。198l；29：进而使K一ATP通道关闭，细胞内K逐渐升高而导361l一6致细胞去极化，电压依赖性ca2通道开放，细胞外3ZhangQH．LinZB．I1leantitumoractivityofC．anodetmaluc／d-／／／Z(Curt：Fr．)P．Karst．(LingZlai)(Apbyllopho~n·ca2内流而诱发胰岛素的释放“]。此机制中，细ycetideae)p0lysaccdesisrelatedtotumornecrosisfactor-T胞外ca2内流是胰岛素分泌的启动信号，也是关键andInterferon-7[J]．IntJMedMushrooms，1999；l：207—15因素。在胰岛B细胞表面有N一。P／Q．和L广型ca24XiaD，LinZB，LiRZ。et．EfectsofC~mMetmapolysac—charidesoniInlnunefunctioninmice[J]．JBeijingMedUniv，通道，促发胰岛素分泌的ca2内流主要是通过IJ-型l989：21：533—6ca2通道实现的L1·”J。本研究发现Gl—PS能直接促5YouYH．unZB．ProtectiveefectsofGanodermalucidumOo．进胰岛B细胞分泌胰岛素。若预先加L广型ca2通1ysaccharidespeoadeoninjmyofmacmphagesinducedby一道阻断剂维拉帕米，由于抑制Ca2内流而导致胰岛fiveo】【ygeIlspecies[JJ．ActaPhannacolSin，2O02；23：787—916HikinoH，KinnoC。Mi面Y，a1．Isolationandhypnglyce·素的分泌量明显抑制，G1．PS的促胰岛素分泌的作用micactivityofG，l0d叽sAandB．glyca~ofCxtaMetmalu-也受到一定的抑制，尽管这种抑制作用并不完全。cidumfruitboaies[J]．PlantaMed，1985；4：339—40当联合应用ca2螯合剂EGTA和维拉帕米，其促胰7HikinoH，IshiyamaM，SuzukiY，eta／．Mechanismsofhypo—岛素分泌的作用则被完全抑制，这些结果表明Gl—PSglycemicactivityof6n0rnnB：aglyc~ofCxtaMetma／／／c／d-啪fruitboaies[J]．PlantaMed，1989；55：423—8在5．6和l6．7mmol·L葡萄糖时的胰岛素的释放8罗少洪，杨红．灵芝多糖调节血糖作用的实验研究[J]．广可能是通过促进胰岛细胞外ca2内流而实现的。东药学院学报。2000；16：ll9—20葡萄糖刺激的胰岛素释放与葡萄糖代谢情况密9BradfordMM．Arapidandsensitivemethodforthequantificationofmicrogramquantitiesofproteinutilizingtheprincipleofpro-切相关，改变葡萄糖代谢情况可改变胰岛细胞的葡tein-dyebinding[J]．AnalBiochem，1976；72：248—54萄糖反应性。与葡萄糖代谢密切相关的是葡萄糖转10HenquinJC．ATP-sensitiveKchannelsmaycontrolglucose-in．运蛋白和葡萄糖激酶。葡萄糖转运蛋白(GLUT1ducedelectricalinpallc~aticBcells[J]．BiochemBiophysRes5，7)是一类介导葡萄糖摄取的膜蛋白，广泛存在于Collilnllln。1988；l56：789—95真核细胞胞膜上。GLUT2主要表达于肝细胞，胰岛llHenquinJC．RoleofvoltageandCa2．dependentKchannelsinthecontrolof#ucose-inducedelectricalinpancreaticBcellsB细胞，小肠和脑等组织中u。胰岛B细胞表达的[J]．EurJPbysiol，l99o；416：568—72葡萄糖转运蛋白2(GLUT2)是其感受葡萄糖刺激一12VathA，SzabadkaiG，VamaiP，eta／．Voltagedependentcal—应答反应功能的前提。生理条件下，葡萄糖可经ciumchannelsinadrenalglomerulosacellsandininsulinpro— 维普资讯http://www.cqvip.com·268·ChinJClinl~rmacolTher2003Jun；8(3ducingceUs[J]．CellCalcium，1998；23：33—42PhammcTher，1995；66：465—50513LigonB，SoyaAER，DLlnlapK．ClassAcalciumchannelvail—15FerrerJ，Gomi$R，FernandezJ，eta／．Signalsderivedfromantsinpancreaticisletsandtheirroleininsulin~re[1on．[J]．sluco~metabolismaIeIeqIlil耐forsluco~regon0fpan-BiolEhem，1998；273：13905—11creaficisletsGLUI2mRNAandprotein[J]．Diabetes，1993；14McgmvanKM，LongSD，PekalaPH．Glucosetransportergene42：1273—80expression：RegulationoftranscriptionandmRNAstability[J]．EfectofGanodermalucidumpolysaccharidesontheinsulinreleasingfunctionofpancreaticisletsinratsZHANGHui．Na．LINZhi．BinDepartmemofPharmacology，BasicMedicalCollegeofPekingUnwersay，＆凡g100083ABSrRACI．删：Toinvestigatetheefectof(Gano．sulinreleasingefectofGI--IX3Waspartlyinhibitedbyver--dermaluc／dum)polysaccharides(GI—PS)ontheinsulin．a1)aIIlilandcompletelyinhibitedbyverapamil+EGTA．releasingfunctionofpancreaticislets．M口EcIlIoDS：Pan—G1-PScouldpromotetheGIJproteinexpressionofcreaticisletswereisolatedandincubatedwith5．6orpancreaticisletsunderglucoseof5．6and16．7l6．7mmol·Lglucoseanddiferentconcentrationsofmmol·L～．CONCLUSION：GI．IX3possessesinsulin—Gl—PSforlh．111entheinsulinwasexamined．Vempam．releasingefectunderthegluc~of5．6and16．7il．andvempamilcombinedEGTAwereusedtotestifymmol·L～duetothepromotionoftheGLUT2proteinex—whethertheinsulin．releasingefectofGI．PSWasinhibitedpressionandthesubsequentfacilitationofcdinflowintobytheseinhibitors．eefectsofGI．PSonproteinex．thepancl'eaticBcells．pressionofthegluc~transporter2(GIJ)under5．6KEYWORDSpharmacology；C．oJlod~rmaluc／dumpo—and16．7mmol·L_。gluc~werealsoinvestigated．RE．lysaccharides；pancl'eaticislets；insulin-releasingfunc--sI)I腮：GI—PSstimulatedtheinsulinreleasewhenincu．tion；glucosetransporter2batedwiththeglucoseof5．6or16．7mmol·L～．111ein．灌羔妊