农杆菌介导的zmdreb2a基因对大豆的遗传转化研究

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1、农杆菌介导的ZmDREB2A基因对大豆的遗传转化研究第一章绪论1.1利用植物基因工程方法提高耐热性研究背景由于气候条件改变，地球的平均温度逐年上升趋势。环境温度的上升导致降雨、干旱，水涝等条件的改变，从而对植物群落的分布产生了消极影响。虽然植物有适应和抵抗温度波动的能力，但是也跟不上全球变暖的速度。有估计表明，预计在未来十年，适度的温暖不但将影响水稻产量，而且对芸苔属、小麦、大豆等其他作物品种也产生类似影响[1]。全球农业产量及其可持续性都将会受高温胁迫的影响。未来让农作物在温室中生长的技术解决方案并不是经济可行的选择。一个更实用的解决方案是改变植物的遗传机制使植物在环境温

2、度升高的情况下仍能生长和繁殖。增强植物耐高温能力能使其在胁迫下存活并把对细胞的伤害降到最低。所有植物都具有内源机制来使其在高温条件下存活率上升。不同种、属间的植物，它们基础的(即在高温下生存的固有能力)和已有的耐热性(即抵抗高温胁迫的已有能力)能力是不同的，对这两种耐热类型的构成成分进行鉴定十分重要。将所需基因从高效耐热型植物引入低效耐热植物中是可行的。如果供体和受体植物物种是近缘的，可采用传统的育种方法。但是如果供体和受体是远缘的，就需要使用转基因方法将目的基因转入受体。用常规育种方法繁育耐高温等抵抗非生物胁迫的植株并不十分成功[2]。原因很多，例如:(1)耐非生物胁迫是

3、由多基因控制，并且运用传统育种方法获得复杂性状是比较困难的。(2)抗性有关的重要基因在相兼容品种间既不已知也不可用[3]。植物内源调控机制也会随着温度变化做出一系列的应答反应。差异同时也随着植物的生长发育对温度变化有不同的应对方法。在作物复制时期对此胁迫的高敏感性对农业成果会产生极大影响[4]。高温对水稻受精作用有消极影响，花粉管萌发和存在时植株对温度高度敏感。在水稻开花时期，尽管环境温度只提高1摄氏度，都会导致大量小穗不育[5]。和水稻类似，不同种植物在受精时期对高温都是敏感的。高温和多种生物胁迫会对细胞造成更严重的伤害。高温胁迫结合干旱、盐碱、高紫外线、臭氧、高光强、杂

4、草竞争和病原体等对作物产量造成极大有害影响[6]。1.2获得耐热转基因植物发现新的耐热基因是限制基因工程方法获得耐热植株的最重要因素。目前的研究主要都集中于发现新的具有耐热功能的基因。高温胁迫使得细胞蛋白紊乱。在超过植物可承受温度下，高温可能导致蛋白质的最佳结构和功能特性发生变化。高温条件下蛋白质失去其生物活性可能因为聚合或蛋白质的错误折叠[16]。高温对细胞造成的伤害于失活蛋白质的积累。细胞受到高温刺激后，蛋白质伴侣和蛋白质降解机制趋向于将对其它蛋白质的损伤降到最低。高温诱导表达的的特异蛋白酶，起到降解异常蛋白质的作用。HSPs的合成是与高温胁迫相关的重要步骤[17]。大

5、量和快速上调HSPs被认为是应答高温胁迫的标志。根据报道，大多数HSPs作为分子伴侣通过稳定或重新折叠变性蛋白质来保护细胞免受高温胁迫损害[18]。HSPs于40年前被发现，时至今日，这类蛋白质仍然为高温胁迫所研究的主要课题。研究表明，HSPs是在植物受到热胁迫时起关键作用的基因。HSPs与高温胁迫相关的证据已经通过制造突变体、反义和RNA干扰抑制HSPs的表达以及过表达HSPs等方式获得。研究表明，在细菌和酵母菌中过表达植物HSP基因能使转化细胞在高温下存活[19]。选取了一些已用于耐高温植物基因工程中的HSPs基因进行讨论。.第二章基因的克隆及其生物信息学分析2.1实验

6、材料2.1.1菌株和载体菌株:LBA4404、EHA105大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α载体：pCBM、pMD18T2.1.2植物材料实验材料：东农50（DN50）..2.2玉米ZmDREB2A基因的克隆2.2.1玉米叶片RNA的提取将龙育二号玉米种子播种于蛭石中，每天浇灌营养液，直至长出第三片嫩叶，40°C处理植株1h后立即剪取叶子，用液氮冷冻研磨，用RNA提取试剂盒提取RNA。玉米叶片RNA的提取（天根生化科技）(1).每次微量提取100-200mg玉米叶片。(2).先将新取玉米叶片剪成小块，放入研钵中研磨，然后加入1mL溶液A。

7、(3).将研磨液转移至无菌的1.5mL无菌塑料离心管中。(4).在离心管中加入0.3mL的溶液B和0.2mL自备氯仿，在振荡器上振荡30秒混匀，此时溶液呈均匀的乳浊状。(5).室温12000rpm离心3-5分钟。(6).将上清液（约0.6mL）转移到另一无菌的1.5mL塑料离心管中，下层有机相和中间层含有DNA、蛋白质和其他杂质，避免触及或吸取。(7).加入与上清液等体积的溶液C，充分颠倒混匀数次。将一半溶液转移至离心吸附柱中，12000rpm室温离心30s，弃穿透液。(8).将剩下的一半溶液转移到上步所用离心吸附