用积分法考察黄嘌呤对candida specie

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1、用积分法考察黄嘌呤对Candidaspecie【关键词】尿酸酶CharacterizationofinhibitionofxanthineonCandidaspeciesuricasebyintegratedmethod　　【Abstract】AIM:Toinvestigatetheprerequisiteoftheintegratedmethodforcharacterizinginhibitorsodel.METHODS:Uricasereactioncurveonitoredbyabsorbancea

2、t293nm.Theapparentkiicparameters(apparentMichaelisMentenconstant,Kmapp,andapparentmaximalreactionrate,Vmapp)atedbynonlinearfittingreactioncurvetotheintegratedMichaelisMentenrateequatione.Theinhibitiontypeandinhibitionconstant(Ki)inedbasedontheresponsesofap

3、parentkiicparameterstoxanthineconcentrations.RESULTS:Outliersinreactioncurvegreatlyreducedthereliabilityofparametersobtainedbythisintegratedmethod.ichaelisMentenconstant,Kmapp)和表观最大反应速度(apparentmaximalreactionrate,Vmapp).据上述参数随抑制剂浓度的变化确定抑制类型和抑制常数(inhibitio

4、nconstant,Ki).结果:被分析数据中的畸异值显著降低结果可靠性.通常终点底物<1/6Kmapp而起始底物足够高，此积分法测定Kmapp的偏差和变异低于20％而Vmapp精度更高.用积分法所得Kmapp与双倒数法一致，且和黄嘌呤浓度成正比，对应Ki为(5.4±0.8)μmol/L(n=3)，也与双倒数法一致.结论:被分析数据精度足够高，用无抑制剂时米氏常数（MichaelisMentenconstant,Km）4倍以上的起始底物浓度并固定终点底物浓度<1/6Km，此积分法能用于筛选特殊类

5、型的抑制剂.　　【关键词】积分法；双倒数分析法；尿酸酶；黄嘌呤；米氏常数；抑制常数　　0引言　　酶抑制剂是新药开发热点.通常据表观米氏常数（apparentMichaelisMentenconstant,Kmapp）和表观最大反应速度（apparentmaximalreactionrate,Vmapp）随抑制剂浓度变化同步确定抑制类型和抑制常数（inhibitionconstant,Ki）筛选抑制剂［1］.双倒数法测定Kmapp和Vmapp筛选抑制剂需要底物浓度分布在米氏常数(MichaelisMenten

6、constant,Km)两侧，且范围应尽量宽.此法测定动力学参数对低浓度底物下初速度误差和底物浓度本身的误差都非常敏感，用于筛选抑制剂的成本也很高.用积分速度方程酶反应曲线，即积分法，可同步确定Km和最大反应速度(maximalreactionrate,Vm).经典积分法所用积分速度方程自变量缺乏统计合理性，所得参数可靠性低［2］.最近发现用以反应时间为自变量的积分速度方程拟合酶反应曲线，能可靠测定酶动力学参数并筛选抑制剂［3-7］.此积分法筛选抑制剂对初始底物浓度误差不敏感，且效率高而成本低.我们用此积分

7、法考察黄嘌呤对Candidaspecies尿酸酶的抑制作用，以期进一步明确此法筛选抑制剂的可靠性和应用条件.　　1材料和方法　　1.1材料　　尿酸、黄嘌呤购自I,Candidaspecies尿酸酶(E.C1.7.3.3)购自Sigma［U0880］.其余试剂为国产分析纯.　　1.2方法　　缓冲液含100μmol/L二乙基三氨基五乙酸［6,7］.反应体系含1.0mL缓冲液，底物、抑制剂和酶液共0.20mL.用双倒数法分析时，酶为0.083μkat/L，记录反应延迟30s后反应1min内的数据.积分法分析时，酶

8、为0.333μkat/L，初始底物浓度为55μmol/L，在(25±0.5)℃以10s间隔记录启动反应40s后底物消耗到<1/8Kmapp(双倒数法测定)的反应曲线.用线性回归确定双倒数法所得参数.积分法测定参数按以前方法分析启动反应40s后光吸收变化>0.001的6个以上数据［7］.用VisualBasic6.0编写程序，数据记录成文件读入，作图鉴别畸异值，结果输出到指定文件.线性回归分析Kmapp