脐血造血细胞体外集落培养最佳收获时机的探讨

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1、脐血造血细胞体外集落培养最佳收获时机的探讨关键词：基质细胞;脐血;集落　　摘要:目的探讨脐血（CB）多系造血集落培养在不同培养条件下脐血造血细胞体外扩增的最佳收获时机。方法将从新鲜CB标本中分离出的单个核细胞（MNC）分别接种于已建立的无血清培养基，该培养基分别含单用人骨髓基质细胞、单用细胞因子及细胞因子联合入骨髓基质细胞（HBMSC）支持培养体系。在0、6、10及14d各时间点分别取细胞进行巨细胞集落形成单位（CFU-MK）、红系爆式集落形成单位（BFU-E）及粒单细胞集落形成单位（CFU-GM）培养。结果在体外培养过程中，第10d时各组CFU-MK、BFU-E及CFU-GM数均

2、高于组内其它时间点（P0.05）;在含HBMSC支持培养的组集落生成数优于其它组（P0.05）。结论脐血MNC体外培养过程中，第10d可能是收获的最佳时机。FIBMSC能更好地维持造血干/祖细胞的活性，使其集落形成能数得到有效扩增。　　关键词:基质细胞;脐血;集落　　Observationontheoptimumtimeforharvestinghematopoieticcellsfromcordbloodaftercultureinvitro.　　　　Abstract:ObjectiveToexploretheoptimaltimeforharvestingcordbloodhe

3、matopoieticcellsculturedinvitrobycolonymulti-plication.MethodsMononuclearcellsseparatedfromcordblood-freesystemsupplementedanbonemarroalcellsofbinationofthem.CFU-MK，BFU-EandCFU-Gmisolidcultureassayond0，d6，d10andd14fordeterminationofprogenitorunmber.ResultsThequantityofCFU-MK，BFU-EandCFU-Gmond1

4、0afterculturee（P0.05）.Thenumberofcolonyformingunitsanbonemarroalcells（P0.05）.ConclusionTheoptimaltimeforharvestingthemononuclearcellsisonthetenthdayafterinvitrocultureofcordbloodhematopoieticcells.Bonemarroalcellsiscapableofmaintainingtheactivityofhematopoieticcellsculturedinvitro.　　Keyalcell;

5、Cordblood;Colony　　脐血中造血干/祖细胞含量少，难以满足大多数成人造血干细胞移植重建造血及免疫功能的需要，限制了其在临床上广泛应用。通过体外培养实现脐血造血细胞的有效扩增便成为解决问题的关键。目前，脐血造血细胞体外扩增的培养体系多包含有不同的细胞因子组合和以骨髓基质细胞为滋养层以及以骨髓基质联合细胞因子等成分支持脐血体外扩增。在前期的研究中证实〔1〕，以上三种方式都可以使脐血造血细胞得到有效扩增，其中以第三种效果最好，但是造血细胞在体外培养过程中不可避免地产生过分化的现象，造成造血细胞体内移植能力的减弱。本实验通过观察扩增后造血干/祖细胞在不同时间点各系集落形成能力

6、的变化，寻找脐血体外培养收获细胞的最佳时机。　　1材料和方法　　1.1人骨髓基质细胞层的建立无菌条件取出正常成人供者骨髓液约5～6ml，经淋巴细胞分离液（聚蔗糖一泛影葡胺，比重为1.077，购自中国医学科学院血液研究所）密度梯度离心制成单个核细胞（MNC）悬液，接种于含15%FBS，100kU/I青霉素，100mg/L链霉素的IMDM培养体系中。细胞接种浓度为2×106/ml，2d后全量换液，以后每周半量换液2次，培养10～14d，基质细胞层融合（约80%）后，经15Gy60Co照射备用。　　1.2脐血MNC液体培养体系无菌采集正常足月妊娠健康产妇的脐血10例，ACDA抗凝，新鲜脐

7、血按4:1体积比加入羟乙基淀粉30～45min去除沉淀的红细胞，经淋巴细胞分离液密度梯度离心分离山MNC悬液备用。无血清培养体系为StemspanTM培养液（Stemcell公司产品）。加入细胞因子SCF、FL及TPO浓度均为40ng/ml（英国Peprotech公司）。脐血MNC接种浓度为1×106/ml。实验分组如下:A、对照组:无细胞因子及HBMSC;B、培养液中含HBMSC:C、培养液中仅含细胞因子:D、培养液中同时含细胞因子及HBMSC，种入25cm2培养瓶