混合移植新鲜的和体外培养1周的脐血造血细胞

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1、混合移植新鲜的和体外培养1周的脐血造血细胞-->混合移植新鲜的和体外培养1周的脐血造血细胞,可能是脐血移植的较好办法【摘要】：目的　探讨经体外扩增的脐血造血细胞对小鼠造血重建功能的影响,寻求脐血用于成人移植的可行方法。方法　将经致死剂量γ射线照射后的BALB/C小鼠,随机分为4组,每组10只。A组:每只移植2.5×106个新鲜脐血细胞;B组:每只分别移植1.25×106个新鲜脐血细胞和1.25×106个扩增培养1周的脐血细胞;C组:每只移植2.5×106个扩增培养1周的脐血细胞;D组:每只仅输注0.5ml生理盐水。比较各组造血重建的差别。结果　在脐血细胞移植后第13d,A组存活5只(50%

2、),B组8只(80%),C组6只(60%),D组全部死亡。B组小鼠的死亡率最低。脐血细胞移植后14d,小鼠的NC),洗涤备用,检测细胞数以及CD34+细胞比例。BALB/C小鼠来自中国科学院上海动物中心,鼠龄8周,体重20g左右,雄性,饲养于无菌层流室,饲料、饮水及垫料均经高压灭菌。2.移植细胞制备:分离好的MNC,留取1/6做体外扩增培养,另5/6立即在程序降温下液氮保存,1周后在42℃水浴中迅速融解,计数细胞数和CD34+细胞比例。体外扩增培养体系:IMDM培养体系中含有体积分数为20%的胎牛血清,细胞因子SCF20ng/ml、FL40ng/ml、IL-320ng/ml、IL-620n

3、g/ml、GM-CSF40ng/ml(五种细胞因子均为英国PeproTech公司产品),MNC浓度为1×106/ml,体系40ml,置于6孔培养板中,每孔4ml,于37℃、体积分数为5%CO2的饱和湿度培养箱中培养7d,收集细胞,洗涤后计数,检测CD34+细胞比例。3.脐血细胞移植及分组:脐血细胞移植前24h内,将BALB/C小鼠经60Coγ射线全身一次性致死剂量照射,总量8.5Gy,剂量率1.09Gy/min。照射后随机分为4组,每组10只。A组:每只移植2.5×106个新鲜脐血细胞;B组:每只分别移植1.25×106个新鲜脐血细胞和1.25×106个扩增培养1周的脐血细胞;C组:每只移

4、植2.5×106个扩增培养1周的脐血细胞;D组:为对照组,每只输注0.5ml生理盐水。每只小鼠输注的细胞体液体积为0.3~0.5ml。4.小鼠重建造血功能的测定:观察小鼠生存情况;于移植后第14、22、30d分别断尾取血,检测小鼠外周血白细胞(I1640冲出骨髓细胞,作人类白细胞抗原CD45+细胞检测。第30d时处死小鼠,取双侧股骨,同法作人类白细胞抗原CD45+细胞检测。5.CD34+细胞与CD45+细胞的检测:应用流式细胞仪(美国BD公司,FACSCalibur型)进行检测,CD单抗购自美国BD公司。人类白细胞抗原CD45+细胞检测:取小鼠骨髓腔冲洗出的细胞,用CD45-FITC单抗进

5、行免疫荧光标记,对照采用鼠IgG-FITC。6.统计学分析:采用四格表精确检验法与方差分析。结果1.移植细胞的处理情况:脐血经Ficoll离心分离后得MNC数3.0×108个,CD34+细胞的比例为1.77%;将5×107个原始脐血MNC体外培养1周后,得细胞数5.5×108个,CD34+细胞占3.82%;将2.5×108个原始MNC冻存1周后速融,收获细胞数2.2×108个,CD34+细胞占1.72%。2.小鼠生存情况:在脐血细胞移植后第13d,A组存活5只(50%),B组8只(80%),C组6只(60%),D组全部死亡。至30d时未再发生死亡,B组小鼠的死亡率最低。A、B、C三组间的存

6、活率差异无显著性(P>0.05)。3.小鼠WBC恢复情况:脐血细胞移植后14d,小鼠的WBC已开始回升,B组与C组的恢复明显较A组快,P0.05,第30d时,各组小鼠的WBC已基本恢复至正常水平。见表1。4.小鼠脾结节检测情况:小鼠脾脏中皆检出了脾结节,A组CFU-S为19,B组为21,C组为17。组织切片发现,CFU-S是由红系、粒系和巨核系细胞组成的造血结节。5.小鼠人类白细胞抗原CD45+细胞检测情况:移植后第13d与30d处死的小鼠,骨髓细胞中均检测到了人类白细胞抗原CD45+细胞,A组2.8%~8.2%,B组2.5%~8.5%,C组2.2%~7.0%。讨论大量研究表明,脐血干细胞

7、移植具有比骨髓及外周血更好的优势,但由于每份脐血所含的造血细胞数量较少,主要用于治疗体重-->的死亡原因可能是脐血造血细胞未能在小鼠体内植活,或是严重的移植后并发症。移植后第13d,我们从小鼠脾脏中检测出由多系细胞组成的混合集落(CFU-S),可能是一种较早期的造血干细胞,它们很可能来自外源输注的人脐血造血细胞。移植后第30d,各组小鼠的plificationandself-reneanprimitivehematopo