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1、在牙种植体表面构建钙磷离子/NGF复合涂层 随着现代口腔种植技术的日益完善,种植义齿修复,在条件允许的情况下,已成为治疗牙列缺损、缺失,恢复口腔咀嚼功能的最佳手段。种植体植入颌骨后与周围骨组织能否形成良好的骨整合(osseointegration),以及骨整合形成的快慢、新生骨组织的质和量是影响种植体成功率的重要因素。 目前临床常用的各类纯钛及其合金种植系统通过微螺纹和/或双螺纹的设计、喷砂-酸蚀(sand-blastedandacid-etched,SLA)的表面处理而具有一定的骨传导能力,但
2、无骨诱导性。近年来,学者们尝试通过种植体表面的生物功能化改性技术,将多种调控骨改建过程的细胞生长因子,如骨形态发生蛋白(bonemorphogeicproteins,BMPs)、血小板衍生因子(platelet-derivedgroburger首先发现,具有促进神经再生和骨折愈合的双重作用,在改善种植体临床效果方面意义重大。因此,本研究拟通过模拟体液(simulatedbodyfluid,SBF)仿生沉积法,在种植体表面构建钙磷离子/NGF复合涂层,以期为种植体成功率的进一步提高和远期效果的进一步改
3、善以及新型口腔种植体的开发提供一定的实验依据。 1、材料与方法 1.1种植体的表面处理 本实验所采用的柱状钛合金(Ti6Al4V)种植体由四川大学国家生物材料工程研究中心提供,表面无螺纹,直径为1.0mm,长度为12mm。所有种植体表面均依次进行了如下处理:240、360、600目砂纸逐级打磨,75μmTiO2颗粒喷砂,丙酮、乙醇、去离子水45℃超声清洗各30min后,干燥备用;63.6%硫酸、10.6%盐酸依次60℃水浴各10min,去离子水45℃超声清洗30min后,干燥备用;5mo
4、l/LNaOH溶液60℃水浴24h,去离子水45℃超声清洗30min,干燥24h后600℃处理1h,无菌条件下储存备用。 1.2涂层的制备 无菌条件下,随机选取表面处理后的种植体,置入钙磷离子浓度为正常值5倍,大鼠NGF浓度为10mg/L的SBF中(Ca2+浓度为2.5mmol/L、HPO2-4浓度为1.0mmol/L、pH=7.40),37℃水浴,每隔24h换液一次,48h后取出,干燥备用。制备完成后的种植体均在-80℃下避光保存。 1.3表面形貌观察 使用JSM-5900LV扫描电子显微
5、镜(电子株式会社,日本;加速电压10kV)观察在4000、100000放大倍数下Ca/P/NGF涂层的表面形貌。 1.4涂层厚度及强度检测 1.4.1涂层厚度的检测种植体(n=3)经聚甲基丙烯酸甲脂(poly-methyl-meth-acrylate,PMMA)包埋后,用金刚锯在种植体长轴中点垂直长轴切开,使用扫描电子显微镜检测其横断面涂层厚度均匀区域的多个位点,取其平均值。 1.4.2涂层结合强度的检测Revetest使用声发射划痕仪(CSMInstruments,瑞士;金刚石球状压头直径0
6、.2mm,划痕速度10mm/min,加载速率20N/min)检测涂层(n=3)的临界载荷。每个试件检测3次,取其平均值。 1.5ELISA法检测涂层所含NGF的总量及体外缓释规律 1.5.1涂层所含NGF总量的检测机械剥离Ca/P/NGF涂层,溶解于1mL含20%乙二胺四乙酸(ethylenediamineyetraaceticacid,EDTA)的溶液中,震荡均匀。将适量所获得的EDTA溶液稀释10倍和100倍后进行NGF浓度的ELISA法检测。 1.5.2涂层体外释出NGF量的检测将Ca/
7、P/NGF涂层(n=6)种植体置入含有5mLPBS的10mL离心管中,37℃水浴摇床,每隔1周换液一次,共4周。每次换液前,先使浸入的种植体脱离液面,用洗耳球尽量将种植体上残留的液体吹入离心管中,震荡均匀。将适量所获得PBS浸泡液稀释10倍和100倍后进行NGF浓度的ELISA法检测。 1.5.3NGF浓度的ELISA法检测将100μL稀释10倍后的样本和100μL稀释100倍后的样本加入大鼠神经生长因子ELISA试剂盒的96孔板中,与标准品一起经第一抗体工作液、酶标抗体工作液、底物工
8、作液、终止液反应后,30min内用酶标仪测定450nm波长处的吸光度。根据标准品绘制的吸光度/浓度曲线,可获得样本中NGF的浓度,再乘以体积(1mL/5mL),计算得出涂层所含NGF的总量以及每1周时间段内体外释出NGF的量。 1.5.4种植体浸泡液钙磷离子浓度的检测及统一使用实验室离子+pH计(IM-55G,DKK-TOA,日本)检测各周种植体浸泡液中钙磷离子的浓度及pH值,并取各周等量浸泡液按照SBF的配制方法配制等量、Ca2+浓度为2.5mmol/L、HPO2
