糖基化终末产物对人表皮角质形成细胞周期调控的影响机制

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1、糖基化终末产物对人表皮角质形成细胞周期调控的影响机制：董叫云，牛轶雯，谢挺，青春，陆树良【摘要】目的通过体外试验探讨糖基化终末产物(AGEs)对表皮角质形成细胞周期调控的影响机制。方法体外培养的人表皮角质形成细胞经AGEs(150mg/ml)作用后，用噻唑兰(MTT)法研究其增殖活力、流式细胞仪研究细胞周期和凋亡率。用小片断RNA干扰(siRNA)的方法阻断细胞中AGEs受体(receptorofAGEs,RAGE)mRNA的表达,realtimePCR鉴定其阻断效率。RTPCR法检测RAGE阻断前后各组细胞内RA

2、F1、黏着斑激酶(FAK)、周期素(cyclin)D1、cyclinB1、周期表依赖性激酶4(CDK4)的核酸水平表达差异。结果经AGEs干预后表皮角质形成细胞增殖活性下降，凋亡率升高，细胞周期G2期的比例显著增高，而细胞周期调控相关因子及信号因子RAF1、cyclinD1、cyclinB1、CDK4的核酸表达较对照组却明显升高，用RAGE阻断以上因子后表达则与对照组相比无差异。结论在上述体外模型下，表皮角质形成细胞的周期调控因子升高，而增殖却下降且凋亡增加，可能是AGEs干预后细胞内启动内源性代偿调控机制，且这

3、种调控机制与其受体(RAGE)途径相关;AGEs也可能还通过以上细胞周期调控因子以外的其他途径或机制影响细胞生物学功能。【关键词】糖基化终末产物;周期素D1;周期素B1;周期素依赖性激酶4;细胞增殖　　Abstract：ObjectiveToexplorethemechanismsofdisorderedcellcycleinkeratinocytesthatediatedbyadvancedglycationendpruducts(AGEs)invitro.MethodsHumanepidermalkeratino

4、cytes(HEK)g/ml),and150mg/mlBSA(bovineserumalbumin)almediumascontrolsinthisstudy.After48hoursofincubation,cellapoptosisandcellcycleeter,andthecellgroethod.ThereceptorsofAGEs(RAGE)edePCR.TheexpressionsofRAF1,FAK,cyclinD1,cyclinB1,CDK4onmRNAlevelsinedg/ml)interru

5、ption.ThepercentagesofG2stagesincellcycleentedsignificantlyandtheexpressionsofcellcyclerelativefactors,suchasRAF1,cyclinD1,cyclinB1,CDK4,RNAlevelsmediatedbyAGEsbeforegenessilencing.Butthereodel,thephenomenaofincreasedcellcyclerelativefactorsandinhibitedcellpro

6、liferationmightbeoneoftheendogenouspensatingmechanismsinkeratinocytestreatedechanismayhaveimpactoncellcycleinotherpathanEpidermalKeratinocytes，C0015C),在HEK基础培养基EpiLife(MEPI500)中培养，添加HEK生长添加剂HKGS(S0015)。细胞在37℃、5%CO2培养箱中生长，隔天换液。用胰酶TE(R001100)消化贴壁细胞，并用中和剂T

7、N(R002100)中和胰酶。所有试验均选用5～10代的细胞。细胞分3组：对照组(control组):细胞培养于上述基础培养液中;AGEs组：细胞以150mg/mlAGEs干预;BSA组：细胞以150mg/ml基质空白对照液干预。细胞株及其培养体系均购于Cascade,INC.U.S.A。　　3MTT检测细胞增殖活性　　5×104细胞接种于6孔板，待细胞融合至70%，分组刺激24、48小时后，各孔加5mg/mlMTT100ml，37℃培养4小时，弃上清液，各孔加300ml二甲亚砜(DMSO)充分震荡15分钟，将液

8、体吸出移至96孔板100ml/孔，于450nm用全波长酶标仪(SM190,MD,U.S.A)读取吸光度值(OD)。　　4流式细胞仪检测细胞周期和凋亡　　细胞接种于25cm2培养瓶中，待生长融合至70%，分组刺激48小时后用TE消化收集细胞，PBS洗涤1次，用膜联蛋白V异硫氰酸荧光黄(AnnexinVFITC)和碘化丙啶(propidiumi