annexinⅱ在人表皮角质形成细胞分化中的表达论文

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1、annexinⅡ在人表皮角质形成细胞分化中的表达论文李习玲连小华张诚杨恬【关键词】角质形成细胞【Abstract】AIM:ToexploretheexpressionofannexinⅡindifferentiationofhumanepidermalkeratinocytes.METHODS:①Normalhumanepidermalkeratinocytes（NHEK）andCa2+freekeratinocytegroedium(KGM).Theproliferationanddifferentiationofkeratinocytesediumandtheexpression

2、ofannexinⅡmunocytochemistry(ICC).②Immunohistochemistryis.RESULTS:①），通过改变培养基中的钙离子浓度来调节NHEK的增殖和分化，采用免疫细胞化学(ICC)技术分别检测annexinⅡ在增殖和分化NHEK中的表达.②采用免疫组织化学（IHC）技术检测成人及新生儿表皮NHEK中annexinⅡ蛋白的表达.结果:①低钙（0.07mmol/L）培养条件下，annexinⅡ呈弱阳性表达，且主要分布于核周.高钙（1.5mmol/L）条件下培养24h后，annexinⅡ仍呈弱阳性表达,但表达的部位出现明显变化，主要分布于细胞间；48h

3、后.freelalhumanepidermalkeratinocytes,NHEK）的分化密切相关［5］，为进一步了解其受体annexinⅡ在NHEK分化中的作用，我们一方面通过建立NHEK增殖和分化的体外培养模型，采用免疫细胞化学(ICC)技术分别检测annexinⅡ在增殖和分化NHEK中的表达；另一方面，选用成人及新生儿的皮肤作为研究对象，采用免疫组织化学（IHC）技术检测annexinⅡ蛋白的表达，以探讨annexinⅡ在人表皮NHEK分化中的作用.1材料和方法1.1材料细胞培养及组织切片的标本，均来自手术环切的成人及新生儿阴茎包皮.1.2方法1.2.1细胞培养将包皮用无菌生理

4、盐水（含青链霉素50×104u/L）清洗干净后，0.5mL/L醋酸洗必泰溶液浸泡10min，去除皮下脂肪，将皮肤剪成0.5cm×1.0cm小块，DHanks液（含青链霉素50×104u/L）清洗3遍，置于2.5g/LDispaseⅡ（Sigma）中，于4℃消化6h，分离表皮和真皮，将分离所得的表皮置于2.5g/L胰酶（Hyclone）中，于室温消化3min，加入含150mL/L胎牛血清（Hyclone）的DHanks液终止消化，吹打制备细胞悬液，1000r离心10min，弃上清，加入含0.07mmol/LCa2+的KGM(CC3158，Cloics)，混匀后按1×109/L接种，于3

5、7℃含50mL/LCO2湿度为950mL/L的培养箱进行培养.当细胞长至70%~80%融合时，即可转至含1.5mmol/LCa2+的KGM［5,6］.1.2.2免疫细胞化学（ICC）方法抗K10mAb(美国Neomarkers公司);抗annexinⅡmAb(AmericanDiagnostic公司);SP试剂盒(北京中山公司产品).具体步骤为：丙酮固定10min，PBS洗3×3min.3mL/LH2O2甲醇封闭15min以阻断内源性过氧化物酶，PBS洗3×3min.正常羊血清封闭非特异性抗原15min后，倾去血清，滴加一抗（K10为1∶100稀释，annexinⅡ为1∶500稀释）

6、，4℃放置过夜.PBS洗3×3min，滴加生物素化二抗，37℃放置30min.PBS洗3×3min，滴加SP,37℃放置30min.PBS洗3×3min，AEC显色，水性封片剂封片，60℃烘烤30min.K10用DAB显色.以10mmol/LPBS替代一抗作为阴性对照，苏木精复染.1.2.3免疫组化（IHC）方法抗annexinⅡmAb(AmericanDiagnostic公司);SP试剂盒(北京中山公司).具体步骤为：皮肤标本在40g/L多聚甲醛中固定24h后浸入300g/L蔗糖脱水24h，低温恒冷切片机切成6μm厚切片，风干后丙酮固定10min，PBS洗3×3min.10mL/L

7、H2O2甲醇封闭15min以阻断内源性过氧化物酶，PBS洗3×3min.正常羊血清封闭非特异性抗原15min后，倾去血清，滴加1∶500稀释的一抗，4℃放置过夜.PBS洗3×3min，滴加生物素化二抗，37℃放置30min.PBS洗3×3min，滴加SP,37℃放置30min.PBS洗3×3min，DAB显色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明.以10mmol/LPBS替代一抗作为阴性对照.2结果培养细胞的结果显示，低钙（0.07mmol/L）条件下，培养的NHEK