痰液脱落细胞fhit基因检测在肺癌早期诊断中的评价

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1、痰液脱落细胞FHIT基因检测在肺癌早期诊断中的评价：庄鹏晖，蒋晓刚，潘承恩，尚东【摘要】　　目的通过检测痰液脱落细胞FHIT基因微卫星不稳定性(microsatelliteinstability,MSI)和杂合性缺失(lossofheterozygosity,LOH)，评价FHIT基因检测在肺癌早期诊断中的敏感性，探讨肺癌筛查的有效方法。方法以液基细胞学为基础，采集并分离高危人群痰液脱落细胞，提取DNA，检测FHIT基因MSI和LOH。结果在肺癌患者中出现MSI或LOH异常的阳性率在41.6%～49.5

2、%之间，以D3S1300最高，达到49.5%，3个位点中至少1个位点出现微卫星异常为72.3%(n=73)，至少2个位点出现微卫星异常为45.5%(n=46)。统计学分析表明，FHIT基因出现MSI或LOH在肺癌和非肺癌患者中的差异有统计学意义(P<0.05)。结论以液基细胞学为基础，检测痰液脱落细胞FHIT基因的MSI和LOH可以作为肺癌早期诊断的新途径。不同微卫星位点出现异常表现的具体形式有所不同，多位点联合检测可以提高诊断的敏感性和特异性。【关键词】液基细胞学痰液标本微卫星不稳定性杂合性缺失

3、肺癌诊断　　ABSTRACT:ObjectiveBydetectingmicrosatelliteinstability(MSI)andlossofheterozygosity(LOH)inFHITgeneinsputumspecimen,ethodtoscreenlungcancer.MethodsBasedonliquidbasedcytology,specimensinhighriskgroup,abstractedDNA,anddetectedMSIandLOHinFHITgene.Resul

4、tsThepositiverateofMSIorLOHatsinglelocusalmicrosatelliteaccountedfor72.3%inlungcancerpatients,tspecimenmaybeameansofscreeninglungcancer.Differentlocimayhavedifferentabnormalappearance;binationdetectioninmultilocusmightraisesensitivity,eansforlungcancers

5、creening.　　KEYyc基因过表达，8p2123、13q等位基因(RB)和17p杂合性缺失等。以上基因异常均发生在原位癌之前，之后才是5q21(APCMCC)杂合性缺失及Kras癌基因突变[1]。因此，对FHIT基因异常的检测可能对早期发现癌前病变、早期诊断及治疗具有重要意义。　　检测微卫星异常的标本除了传统的肿瘤组织外，还有支气管灌洗液分离得到的细胞和痰液等。由于支气管镜检费用较高、痛苦较大、并发症较多，很难开展早期诊断的筛查。液基细胞学处理的痰液标本，可得到脱落细胞并去掉杂质。在我们先

6、前的研究中，液基细胞学处理明显提高了痰液标本的诊断准确率和敏感性[2]，因此液基细胞学标本是很好的分子生物学研究平台，适合进行免疫组化和RTPCR分析等多种实验性研究。液基细胞学与分子生物学的结合将为临床肺癌筛查提供更客观、更早期的检查手段，对于提高肺癌早期诊断的检出率有重要意义。　　1材料与方法　　1.1标本　　收集西安交通大学医学院第一附属医院2006年2月至2006年9月临床送检的肺癌高危人群痰液标本287例。嘱患者在早晨排痰以后，留取上午8～9时的新鲜痰并及时送检。痰量很少或没有自然排痰者，可

7、采用雾化吸入法促进排痰。每例患者连续送检3d。在287例痰液标本中,最终经纤维支气管镜活检或手术治疗得出病理诊断为肺癌的是101例。　　1.2标本处理　　收集痰液于已消毒的50mL试管中，加入等体积标准固定液，双层消毒纱布过滤滤液，4℃2500r/min离心5min，沉淀物用PBS、ddH2O2mL分别洗涤各2次(2500r/min离心5min)，沉淀物(即脱落细胞)冻存于-20℃冰箱或直接用于DNA提取。　　1.3DNA提取　　脱落细胞按DNA抽提试剂盒(GenomicDNApurificationK

8、it)说明书进行：取冻存的细胞置于37℃水浴中解冻5min；加入600μL核裂解液至细胞混悬液中，吹打至无细胞结块；加入3μLRNA酶溶液至溶液中；加200μL蛋白沉淀液至上述溶液中；小心将上清液移至另一装有600μL室温异丙醇的离心管中，轻柔晃动试管，只至线状DNA形成团线状；加600μL室温700mL/L乙醇至离心管中，轻柔颠倒几次以洗涤DNA；加100μLDNA再水合液溶解DNA，4℃过夜溶解DNA并保存备用。　　1.4微卫星引物