多酚氧化酶的活性在青枯雷尔氏菌中的表达 摘要：青枯雷尔氏菌的基因

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1、多酚氧化酶的活性在青枯雷尔氏菌中的表达摘要：青枯雷尔氏菌的基因序列表明，几个特定的基因编码多酚氧化酶。为了研究这些基因的实际表达，我们发现在微生物细胞提取物中各种多酚氧化酶活性，包括漆酶、甲酚酶、儿茶酚氧化酶活性。多酚氧化酶生化实验条件从石碳酸培养基、PH和十二烷基硫酸钠的浓度上最优化。已经证明，3种不同PPO表达出来。该基因编码的酶与酶活性有明确的关系，该酶活性通过用自杀质粒插入突变一代的无效基因突变来检测，还可通过与野生型菌株相比检测酶活性水平的变化来检测酶活性。RSp1530是一个含有双铜的漆酶蛋白活性位点。其他两个基因：RSc0337和RSc1501，编码铜蛋白表现出酪氨

2、酸酶的异体同型体。RSc0337的基因产物具有很强的酪氨酸羟化酶活性，已经表明，这种酶参与青枯雷尔氏菌的黑色素合成。RSc1501的基因产物是一种倾向于氧化多酚的酶。获得的突变体初步表明，多酚氧化酶在青枯菌中的表达可能参与抵抗酚类化合物，因为突变体对L-酪氨酸比野生型菌株表现出较高的灵敏度。这些结果表明在致病过程中，酚类化合物可能参与诱导植物抵抗机制。多酚氧化酶（PPOs）是一组含铜的金属蛋白酶，能够催化氧化芳香族化合物的氧（32）。多酚氧化酶有两种主要类型：漆酶（EC1.10.3.2）和酪氨酸酶（(EC1.14.18.1）。酪氨酸酶催化两种反应：羟基化反应（单酚酶活性），如催化

3、L-酪氨酸羟基化转变为L-多巴。并且氧化L-多巴和其它氧化型二元酚形成醌（二酚酶活性EC1.10.3.1）。漆酶氧化主要是对还原型二元酚和含甲氧基的酚类化合物，如邻苯二甲酸二甲酯（DMP）。虽然基因组测序表明编码该酶活性的基因广泛的分布，但在细菌界有一些多酚氧化酶的例子已经在分子水平上被表述(1,6)。漆酶的活性第一次在产脂固氮螺菌中被描述（13）。最近，漆酶的活性在其他微生物中被描述，例如海洋单胞菌（34）、枯草芽孢杆菌(23)和大肠杆菌(14)。细菌的酪氨酸酶首次在链霉菌中被报道与该种的黑色素合成有关（16）。酪氨酸酶活性也与苜蓿中华根瘤菌(25)和海洋单胞菌(19)的褐化有

4、关。至少在链霉菌和海洋单胞菌的酪氨酸酶基因中存在一个操纵子连同第二个基因一起参与将铜转移到酪氨酸酶前体上。黑素原主要细菌海洋单胞菌是第一次发现表达两种不同的多酚氧化酶的原核生物。PPOs其中之一是酪氨酸酶，它明确参与黑色素合成，该酶在活体外由十二烷基硫酸钠（SDS）强烈激活；另一种多酚氧化酶是一种膜结合的漆酶，该酶的生理作用仍不明确（30，34）。在本报道后，有共存的酪氨酸酶和漆酶在其他一些属中得到证明。例如，漆酶活性在链霉菌(3,11)和根瘤菌（5）中得到证明，其酪氨酸酶活性先前已被描述（16，25）。但是，在这两种多酚氧化酶表达的可能生理条件即在底物特异性的密切相关性上没有数

5、据。在一些微生物，特别是在真菌中，黑色素的合成和酶的活性已涉及发病机理（27）。对于植物的细菌病原体，一个简单的搜索发现不同基因特定地编码PPOs。此外，许多微生物称为微生物，实际上表达酶活性的是与植物相结合的细菌，如产脂固氮螺菌、苜蓿中华根瘤菌和海洋真菌Microbulbiferdegradans(17,33)。植物使用不同的途径来抵御病原体。最强大的防御系统是植物过敏性反应。这是一个非常协调一致的反应，包括局部地细胞死亡（细胞程序性死亡）、局部地积累高水平的酚类化合物和加固细胞壁（35）。此外，植物产生多种多样的次生代谢产物参与了抵抗微生物病原体。虽然这些防御化合物是植物界的

6、特殊选择，但是一些化学成分，如苯丙衍生物，经常参与这些保护程序（10）。通常，与植物相互作用的细菌中存在特定的编码PPOs的基因，并且，在病原微生物中特别表明微生物表达多酚氧化酶活性的能力和感染力之间的关系促使我们研究这些活性是否真的在微生物中表达。我们选择了青枯菌作为一个合适的模式，因为这种生物体是植物病原菌，可引起茄科属植物的萎蔫和死亡，如土豆和西红柿，其基因组已经被测序（29）。材料和方法菌株，质粒，溶剂用于此项研究的该细菌菌株、质粒、引物见列表1。青枯菌通常是生长在基础生理盐水中（BSM）：50mM钠钾磷缓冲液（pH7.0）中含有15mM(NH4)2SO4、0.8mMMg

7、Cl2、2uMFeSO4、0.2mMCaCl2、8uMNa2MoO4、5uMMnCl2，0.5％甘油和0.01％酵母提取物。用在另一些实验中的培养基是PCG，其中包括（每升）10克蛋白胨、1克酪蛋白水解物，以及5克葡萄糖。大肠杆菌通常生长在LB培养基上。必要时，培养基里可加入50g/ml.浓度的卡那霉素、氨苄西林、利福平。解释青枯菌突变体的酶活性受到影响几个特定编码多酚氧化酶活性的基因突变株可由同源重组产生。首先，RSc1501基因的PCR扩增使用适当的正向和反向引物（分别为F1