玉郎伞多糖对过氧化氢诱导大鼠原代肝细胞损伤的保护作用论文

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1、玉郎伞多糖对过氧化氢诱导大鼠原代肝细胞损伤的保护作用论文段小群，焦杨，张士军，黄仁彬【摘要】目的研究玉郎伞多糖(YLS)对H2O2诱导大鼠原代肝细胞损伤的保护作用及其机理。方法采用IV型胶原酶灌流法分离大鼠肝细胞进行原代培养，用H2O2体外诱导肝细胞损伤，检测培养上清液中AST和ALT水平，测定肝细胞中MDA和GSH含量，MTT法检测细胞存活和增殖活性。结果YLS（0.125～1mg/ml）可明显降低或恢复由H2O2升高的培养上清液中AST和ALT水平及肝细胞中MDA含量.freelechanismofYulangsa

2、npolysaccharide(YLS)onprimaryculturedrathepatocytesinjuryinducedbyH2O2.MethodsTheprimaryrathepatocytesalondialdehyde(MDA)andglutathion(GSH)inhepatocytesandthelevelsofASTandALTinculturalsupernatantinedbygeneralmethods.Cellviabilityethod.ResultsTheelevationofMDAco

3、ntentinhepatocytesandASTandALTlevelsinsupernatantofculturalhepatocytes,andthedecreaseincellviabilityandGSHcontentinducedbyH2O2arkablybythetreatmentg/ml）.ConclusionTheresultssuggestthatYLSpossessesdirectprotectiveactiononprimaryhepatocyteinjuryinducedbyH2O2.Thism

4、ightbeassociateda公司)；RPMI1640(Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；H2O2(重庆川江化学试剂厂)；维生素E(Sigma公司)；台盼蓝(SigmaT6146，北京拜尔迪生物公司分装)；噻唑蓝（MTT，Amerisco，北京拜尔迪生物公司分装）；DHanks缓冲液（自配）；Hanks缓冲液（自配）；二甲基亚砜（DMSO，天津化学试剂有限公司）；天门冬氨酸转换酶(AST)、丙氨酸氨基转换酶(ALT)试剂盒（南京建成生物工程研究所）；丙二醛(MDA)试剂盒（南京建成生物工程研究所）

5、；谷胱甘肽(GSH)试剂盒（南京建成生物工程研究所）。1.3仪器HL2型恒流泵（上海精科实业有限公司）；CO2恒温培养箱（美国ThermoForma，Model311）；TDL802B台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；XD-101倒置显微镜（南京江南光电集团股份有限公司）；SZX型超净工作台（上海浦东跃欣科学仪器厂）；722s型可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；450型酶标仪（美国BioRad）。2方法2.1大鼠原代肝细胞的分离及原代培养［3，4］大鼠用20%乌拉坦腹腔麻醉后，固定四肢，腹部消毒后，无菌

6、操作下，打开腹腔，将肠管推向左侧，暴露门静脉和下腔静脉，小心分离穿线各一根，门静脉穿刺静脉留置针，退出针芯，结扎牢固。将留置管连接输液管，开启恒流泵，灌流37℃预热DHank's液，流速15ml/min，迅速剪开下腔静脉放血。同时打开胸腔暴露并结扎上腔静脉。灌流约10min后，肝脏颜色呈黄白色。下腔静脉插入硅胶管，结扎牢固。改用含0.05%IV型胶原酶的Hanks液（37℃预热）15ml/min，约15min后，肝脏软化，压之凹陷不易恢复，迅速取下完整肝脏，连同含胶原酶灌流液置于平皿中，剔除肝包膜，轻柔摆动肝组织，让

7、细胞慢慢游离出来，200目筛过滤得细胞悬液。600r/min离心，弃上清，沉淀加1640培养液吹打混匀，800r/min离心，共洗涤两次。用血球计数板（台盼蓝拒染法）测定细胞活率及细胞密度。用1640培养液调整细胞密度为5×105/ml，肝细胞活力大于90%。将上述肝细胞悬液加入96孔和24孔培养板中，置37℃，5%CO2培养箱中培养12h后，肝细胞全部贴壁生长，供试验用。2.2YLS对H2O2诱导肝细胞损伤的作用［5,6］维生素E作阳性对照，用少量DMSO溶解，加入到培养液后其终浓度为50μmol/ml。取上述贴壁生

8、长的肝细胞，设H2O2模型组、YLS（0.125～1）mg/ml4个剂量组和空白对照组、维生素E组，每组至少设6个复孔。分别加入H2O20.6mmol/L，不同浓度的YLS,维生素E和溶媒，继续培养24h后，收集培养上清检测AST,ALT活性；弃肝细胞培养上清，加入0.2mlTriton-100水溶液0.5ml，混匀，2500r/