玉郎伞多糖对过氧化氢诱导大鼠原代肝细胞损伤的保护作用

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1、玉郎伞多糖对过氧化氢诱导大鼠原代肝细胞损伤的保护作用作者：段小群，焦杨，张士军，黄仁彬【摘要】目的研究玉郎伞多糖(YLS)对H2O2诱导大鼠原代肝细胞损伤的保护作用及其机理。方法采用IV型胶原酶灌流法分离大鼠肝细胞进行原代培养，用H2O2体外诱导肝细胞损伤，检测培养上清液中AST和ALT水平，测定肝细胞中MDA和GSH含量，MTT法检测细胞存活和增殖活性。结果YLS（0.125～1mg/ml）可明显降低或恢复由H2O2升高的培养上清液中AST和ALT水平及肝细胞中MDA含量，还可提高H2O2降低的肝细胞存活率和GSH含量。结论提示YLS对大鼠原代培养肝细胞损伤有直接保护作用，该作用

2、可能与其抗氧化作用有关。【关键词】玉郎伞多糖；肝细胞；过氧化氢；抗氧化作用　　Abstract：ObjectiveTostudytheprotectiveeffectanditsmechanismofYulangsanpolysaccharide(YLS)onprimaryculturedrathepatocytesinjuryinducedbyH2O2.MethodsTheprimaryrathepatocytesalondialdehyde(MDA)andglutathion(GSH)inhepatocytesandthelevelsofASTandALTinculturals

3、upernatantinedbygeneralmethods.Cellviabilityethod.ResultsTheelevationofMDAcontentinhepatocytesandASTandALTlevelsinsupernatantofculturalhepatocytes,andthedecreaseincellviabilityandGSHcontentinducedbyH2O2arkablybythetreatmentg/ml）.ConclusionTheresultssuggestthatYLSpossessesdirectprotectiveaction

4、onprimaryhepatocyteinjuryinducedbyH2O2.Thismightbeassociateda公司)；RPMI1640(Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；H2O2(重庆川江化学试剂厂)；维生素E(Sigma公司)；台盼蓝(SigmaT6146，北京拜尔迪生物公司分装)；噻唑蓝（MTT，Amerisco，北京拜尔迪生物公司分装）；DHanks缓冲液（自配）；Hanks缓冲液（自配）；二甲基亚砜（DMSO，天津化学试剂有限公司）；天门冬氨酸转换酶(AST)、丙氨酸氨基转换酶(ALT)试剂盒（南京建成生物工程研究所）；丙二醛(MDA)试剂盒（

5、南京建成生物工程研究所）；谷胱甘肽(GSH)试剂盒（南京建成生物工程研究所）。　　1.3仪器HL2型恒流泵（上海精科实业有限公司）；CO2恒温培养箱（美国ThermoForma，Model311）；TDL802B台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；XD-101倒置显微镜（南京江南光电集团股份有限公司）；SZX型超净工作台（上海浦东跃欣科学仪器厂）；722s型可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；450型酶标仪（美国BioRad）。　　2方法　　2.1大鼠原代肝细胞的分离及原代培养［3，4］大鼠用20%乌拉坦腹腔麻醉后，固定四肢，腹部消毒后，无菌操作下，打开腹腔，将肠管推向

6、左侧，暴露门静脉和下腔静脉，小心分离穿线各一根，门静脉穿刺静脉留置针，退出针芯，结扎牢固。将留置管连接输液管，开启恒流泵，灌流37℃预热DHank's液，流速15ml/min，迅速剪开下腔静脉放血。同时打开胸腔暴露并结扎上腔静脉。灌流约10min后，肝脏颜色呈黄白色。下腔静脉插入硅胶管，结扎牢固。改用含0.05%IV型胶原酶的Hanks液（37℃预热）15ml/min，约15min后，肝脏软化，压之凹陷不易恢复，迅速取下完整肝脏，连同含胶原酶灌流液置于平皿中，剔除肝包膜，轻柔摆动肝组织，让细胞慢慢游离出来，200目筛过滤得细胞悬液。600r/min离心，弃上清，沉淀加1640培养

7、液吹打混匀，800r/min离心，共洗涤两次。用血球计数板（台盼蓝拒染法）测定细胞活率及细胞密度。用1640培养液调整细胞密度为5×105/ml，肝细胞活力大于90%。将上述肝细胞悬液加入96孔和24孔培养板中，置37℃，5%CO2培养箱中培养12h后，肝细胞全部贴壁生长，供试验用。　　2.2YLS对H2O2诱导肝细胞损伤的作用［5,6］维生素E作阳性对照，用少量DMSO溶解，加入到培养液后其终浓度为50μmol/ml。　　取上述贴壁生长的肝细胞，设H2O2模型组、Y