幽门螺杆菌 γ谷氨酰转肽酶基因的克隆及序列分析

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1、幽门螺杆菌γ谷氨酰转肽酶基因的克隆及序列分析：唐炜，张尤历，王文兵，陈慧娟【摘要】目的：克隆不同疾病的幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)γ谷氨酰转肽酶（Gammaglutamyltranspeptidase，GGT）基因，并进行序列分析。方法：从人胃黏膜组织中分离培养获得Hp，提取其基因组DNA，对GGT基因进行PCR扩增，克隆进pMD18T载体，进行测序和生物信息学分析，并与基因库中公布的标准株26695和J99的GGT氨基酸序列进行比对分析。结果：成功克隆了分别于

2、慢性胃炎，胃溃疡，十二指肠溃疡和胃癌的4种Hp菌株GGT片段，并进行了序列分析。4种病源的HpGGT序列大小均为1704bp，编码567个氨基酸，理论分子质量是61kDa，等电点是9.3，在N端具有信号肽，含有ATP蛋白激酶结合结构域和γ谷氨酰转肽酶保守结构域。序列比对分析显示，不同的Hp菌株GGT具有很高的保守性。结论：GGT在Hp中高度保守，具有分泌作用，可能对宿主细胞产生影响。该基因的成功克隆为进一步研究其功能打下了基础。【关键词】幽门螺杆菌；γ谷氨酰转肽酶；基因克隆；序列分析；信号肽［

3、Abstract］Objective:Tocloneandanalyzetheγglutamyltranspeptidase(GGT)geneofHelicobacterpylori(H.pylori).Methods：ThestrainsofH.pylorihumangastricmucosaedium.TheGGTamplifiedbyPCRfromH.pyloriDNAaticsmethod.Thesequencesinoacidsinalandthereyltranspeptidases

4、ignature.Thesequenceanalysisshoinoacidsequencesinoacidandhasanimportantroleinhostcells.Cloningthisgeneyltranspeptidase;genecloning；sequenceanalysis;signalpeptide自从1983年ashall由人胃黏膜分离出幽门螺杆菌（Helicobacterpylori,Hp）后，Hp感染与慢性胃炎（chronicgastritis,CG）、胃溃疡（gast

5、riculcer,GU）、十二指肠溃疡（duodenalulcer,DU）和胃癌（gastriccancer,GC）等疾病的关系逐步被人们所认识［1］。国际癌症机构已将Hp列为Ⅰ级致癌因子［2］。γ谷氨酰转肽酶(Gammaglutamyltranspeptidase，GGT)是一种催化肽基转移作用的酶，广泛存在于原核和真核细胞中［3］，在动物体内主要存在于肾、肝、胰等脏器，在谷胱苷肽的新陈代谢中起到了重要的作用［4］。Hp分泌的GGT通过抑制CD4+T细胞的增殖，从而抑制了CD4+T细胞对Hp

6、的清除作用，可见GGT对Hp的定植有一定的作用［5］。GGT参与诱导Hp介导的程序性细胞死亡，可能是一个较好的抗肿瘤因子［6］。但程序性细胞死亡的持续发生，破坏了新细胞生成和细胞消亡之间的平衡从而产生病理作用［7］，凋亡调节基因的转变和突变的频繁发生，反而增加了胃癌发生的危险性［8］。有关GGT的生物学机制和在体内的效应还需要进一步的研究。本实验采用PCR技术分别扩增出了于胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡和胃癌的4种H.pylori菌株的GGT片段，并进行克隆和序列测定、序列分析，以了解GGT基因在致病

7、过程中的变化情况，为进一步研究GGT的生物机制提供了依据。1材料与方法1.1材料　临床Hp菌株由本院内镜室活检标本分离培养获得。Hp基础培养基、微需氧环境发生袋、选择性抗生素及厌氧培养罐购自德国Merck公司。改良布氏肉汤培养基由上海腹泻疾病控制中心提供。无菌羊全血购自金坛欣迪公司。大肠埃希菌E.coliDH5α为江苏大学生命科学研究院实验室保存。pMD18T载体、LATaq酶、质粒抽提试剂盒为TaKaRa公司产品。酵母提取物、蛋白胨为OXOID公司产品。其他常规试剂为市售分析纯。1.2实验方

8、法1.2.1Hp的培养活检组织标本经快速尿素酶试验证实Hp阳性，结合胃镜和病理结果分析诊断为慢性胃炎（5例），胃溃疡（5例），十二指肠溃疡（5例）和胃癌（5例）。将于这4种疾病类型的活检新鲜组织用接种环均匀涂于固体琼脂培养基，在微需氧环境下，37℃培养约3～5天后收集细菌。1.2.2Hp基因组DNA提取刮取培养96h的菌落，按以下步骤提取DNA：用500μlPBS液重悬细菌，4℃，12000r/min离心10min；弃上清，100μlTE液重新悬浮细菌，加入500μlGES液混匀，