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1、棉花育性恢复基因的克隆与表达载体的构建1、相关定义1.1、RNAi的定义及特点RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是近年来发展起来的新技术,已成为目前分子生物学研究中最活跃的热点之一。它指由双链RNA(double-strandedRNA,dsRNA)诱导的序列特异性的转录后基因沉默机制,能在多种生物中抑制特异基因的表达。RNAi所具有的特异性、稳定性、高效、快速以及不改变基因组的遗传组成等特性为人们研究未知功能的基因提供了新的反向遗传学手段。在拟南芥和水稻等基因组测序完成后,RNAi这一新技术在植物功能基因组学研究及植物的遗传改
2、良等方面提供了一个强有力的手段。随着后基因组时代的到来,需要大规模高通量地研究基因的功能。RNAi技术作为一项快速、高效、便于操作的使靶基因失活的技术可以非常有效地鉴定特定基因的功能,表现出比反义和核酶等基因表达抑制技术更优越的特性,因而正在成为功能基因组研究的有力工具。1.2、基因操作的基本概念和技术原理质粒:是一类在细菌细胞内发现的染色体外自主复制的环形双链DNA分子,有些质粒还能整合到染色体基因组上面。载体:可以用来插入外源DNA片段构建重组DNA分子并导入寄主活细胞的质粒获噬菌体统称为基因克隆载体简称为载体[17]。克隆:在分子生物学中,带
3、有一段DNA插入序列的一个寄主(载体单位)(例如细菌寄主中的重组质粒载体)。表达载体:一类按特殊要求设计构建的,具有调节外源基因表达的转录及转译控制信号的,并能使克隆基因在转化的寄主细胞中得到有效表达的专门载体。大肠杆菌的表达载体可区分为表达型质粒载体和表达型噬菌体载体两种类型。启动子:位于基因上有的一段具有特殊功能的DNA序列,RNA聚合酶正是通过它的结合作用而启动基因的转录。原核基因启动子具有-10和-35等结构元件,而真核基因启动子则具有TATA盒及上游元件等特征性结构[18]。转化:细菌的转化指细菌捕获游离的DNA;并使此DNA编码的遗传信
4、息组入细菌染色体以成为永久遗传组成部分;正常的真核细胞由于受到致瘤病毒的感染而转变成恶性细胞的过程也叫做转化;目前认为,凡外源DNA导入细胞的过程都可泛称为转化[19]。核酸的凝胶电泳基本原理:琼脂糖是一种线性多糖聚合物,系从红色海藻产物琼脂中提取出来的。当琼脂糖溶液加热到沸点后冷却凝固便会形成良好的电泳介质,其密度是由琼脂糖的浓度决定的。经过化学修饰的低熔点的琼脂糖,在结构上4比较脆弱,因此在较低的温度下便会熔化,可用于DNA片段的制备电泳。凝胶的分辨能力同凝胶的类型和浓度有关。琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2~50Kb之间;而要分辨小分子
5、量的DNA片段,则要用聚丙烯酰胺凝胶,其分辨范围为1个碱基对到1000个碱基对之间。凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小,浓度越高孔隙越小,其分辨能力也越强;反之,浓度越低孔隙越大其分辨能力也越弱。例如,20%的聚丙烯酰胺凝胶分辨力可达1~6bpDNA小片段,而要分离1000bp的DNA片段,则要用3%的聚丙烯酰胺的凝胶。再如,2%的聚酯糖凝胶可分辨小到300bp的双链DNA分子,而对于较大片段的DNA,则要用低浓度(0.3%~1.0%)的琼脂糖凝胶。在凝胶电泳中,加入溴化乙锭染料对核酸分子染色之后,将电泳标本放置在紫外光下观察,便可以十分敏感而方
6、便地检测出凝胶介质中DNA的谱带部位,即使每条DNA带中仅含有0.05μg的微量DNA,也可以被清晰地显示出来。这是因为溴化乙锭是一种具扁平分子的核酸燃料,可以插入到DNA获RNA分子的碱基之间,并且在300nm波长的紫外光照下放射出荧光,所以可以用来显现琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶中的核酸分子。PCR技术的基本原理及特点[20]:PCR技术快速敏感简单易行,其原理并不复杂,与细胞内发生的DNA复制过程十分类似。首先,双链DNA分子在临近沸点的温度下加热时便会分离成两条单链的DNA分子,然后DNA聚合酶以单练DNA为模版并利用反应混合物中的四种脱氧核
7、苷三磷酸合成新生的DNA互补链。此外,DNA聚合酶同样需要有一小段双链DNA来启动新链的合成。因此,新合成的DNA链的起点,事实上是由加入在反应混合物中的一对寡核苷酸引物在模版DNA链两端的退火位点决定的。这是PCR的第一个特点,及它能够指导特定DNA序列的合成。在为每一条链均提供一段寡核苷酸引物的情况下,两条单链DNA都可作为合成新生互补链的模版[21]。由于在PCR反应中所选用的一对引物,是按照与扩增区段两端序列彼此互补的原则设计的,因此每一条新生链的合成都是从引物的退火结合位点开始,并沿着相反链延伸。这样,在每一条新和成的DNA链上都具有新的
8、引物结合位点。然后反应混合物经再次加热使新、旧两条链分开,并加入下轮的反应循环,及引物杂交、DNA合成和链的分离。PCR反
