花生cem1基因的克隆及表达载体构建

《花生cem1基因的克隆及表达载体构建》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、转自发表吧论文范文发表论文发表花生CEM1基因的克隆及表达载体构建作者:张廷婷等摘要：通过规模测序和生物信息学分析，从花生荚果不同发育时期全长cDNA文库中筛选出MADS-box家族的一个cDNA全长序列，命名为CEM1基因（GenBank登录号为EY396043）。该基因全长1061bp，包含762bp的开放阅读框，编码253个氨基酸，蛋白质的分子量为29405ku，等电点（pI）为918。蛋白质信号肽分析和疏水性分析表明，该基因编码的蛋白质信号肽剪切的可能性很小，具有亲水性。同时构建CEM1基因的VI

2、GS表达载体，为进一步研究该基因的功能奠定了基础。　　关键词：花生；荚果发育；CEM1基因；生物信息学；载体构建　　中图分类号：Q785：S565.2文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）08-0009-06　　MADS-box的名称来自酿酒酵母转录因子MCM1、拟南芥花同源异型基因蛋白AGAMOUS、金鱼草花同源异型基因蛋白DEFICIENS和人血清应答因子SRF4种蛋白的首字母，这4种蛋白质都有一个由56～58个氨基酸组成的高度保守的MADS盒，编码含有这种保守序列蛋白因子的基因称为M

3、ADS-box基因。病毒诱导的基因沉默（Virus-inducedgenesilencing，VIGS）是近年来发现的一种转录后基因沉默现象，可以引起内源mRNA序列特异性降解[1，2]，即如果在病毒载体中加入目的基因片段，侵染寄主植物后，植物会表现出目的基因功能丧失或者表达水平下降的表型，从而确定基因功能。其作用机制为：含有目的基因片段的病毒载体在被侵染的植物组织中大量复制，病毒载体中的目的片段在RNA引导的RNA聚合酶作用下合成大量的双链RNA（Double-strandedRNA，dsRNA）；ds

4、RNA在Dicer酶的作用下产生21～25个核苷酸的短干扰RNA（SmallinterferingRNA，siRNA）；然后，siRNA的反义链和RNA诱导的基因沉默复合物（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC）结合，特异性识别细胞质中目的基因的单链mRNA，造成目的基因mRNA的特异性降解，从而导致目的基因在RNA水平上的沉默[3～5]。本试验克隆了花生MADS-box基因，对其及编码的蛋白进行生物信息学分析，并构建了VIGS表达载体，为转基因奠定基础，这对花生分子育种实践以

5、及阐明果实与种子发育相关的遗传和生理现象具有重要意义。　　1材料与方法11试验材料　　1.1.1植物材料本研究所用材料为花生品种闽花6号。　　1.1.2试剂与仪器本研究所用逆转录酶、DNA酶、ExTaq酶、RNA酶抑制剂、内切酶NcoⅠ和PstⅠ、dNTPs等购自大连宝生物公司；DNA胶回收试剂盒购自北京博大泰克公司；质粒提取试剂盒购自北京博大泰克公司；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；其它化学试剂为国产分析纯。　　Biometra转自发表吧论文范文发表论文发表PCR仪购自华粤行仪器有限公司；U

6、V-2800/2802/2802S型紫外可见分光光度计购自尤尼柯（上海）仪器有限公司；UV-2000系列紫外分析仪购自天能科技（上海）有限公司。　　2结果与分析　　2.1花生CEM1基因的克隆　　通过全长cDNA文库筛选和EST测序得到了该基因的EST序列，其克隆号为2P7，命名为CEM1，GenBank登录号为EY396043。双向测序结果表明CEM1全长1061bp，包含一个762bp的ORF，编码253个氨基酸（图1），相对分子量为29405ku，理论等电点（pI）为918。将该基因序列在NCBI中

7、进行Blast比较，结果与豌豆已知基因（GenBank登陆号为AAX69070）的同源性为79%；将推导的氨基酸序列在蛋白数据库里进行Blast分析，结果与一个花生MADS-box基因氨基酸序列同源性为84%，由此确认CEM1是花生MADS-box基因。　　2.2CEM1蛋白序列分析　　将推导的CEM1氨基酸序列与其它10个物种来源的MADS-box氨基酸序列进行比对并构建系统进化树。序列比对结果显示CEM1与大豆的AGL1（GI：358248235）序列比较一致，与苜蓿等其它来源的氨基酸序列也存在一定的

8、同源性（图2）。系统进化树结果显示CEM1与大豆AGL1亲缘关系较近（图3）。　　2.3CEM1蛋白的结构域、信号肽与疏水性分析　　将推导的CEM1氨基酸序列进行保守区域分析，发现该序列有两个保守结构域：MADS_MEF2_like功能域和K-box结构域（图4）。具有MADS-box蛋白的典型结构。　　3讨论　　MADS-box是一类数量庞大的基因家族，其编码的蛋白是一类转录因子，具有高度保守的MADS-box结构域和半保守